[发明专利]一种应用于慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物的制备方法

说明书

本发明涉及一种应用于慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的组合物，以及一种应用于慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物的制备方法，以及所述组合物和所述制备方法获得的药物在制备治疗慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物中的应用；本发明采用HBV慢性化阳性小鼠模型证实了采用所述组合物对HBV慢性化阳性的小鼠模型的脾脏细胞进行体外刺激处理，将刺激后脾脏细胞作为慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物，回输到HBV慢性化阳性的小鼠模型体内，发现能够显著降低小鼠体内的HBV病毒水平，甚至是清除HBV病毒；为未来慢性乙肝患者的体外细胞免疫疗法奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种应用于慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物的制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

慢性乙肝病毒(Hepatitis b virus，HBV)感染是一个全球公共卫生问题。全世界约有2.5亿人为慢性乙肝感染患者，中国约有8600万，每年约有60万人死于乙肝病毒引起的相关疾病。

目前，在临床上用于慢性乙肝患者治疗的临床手段主要是干扰素和核苷类似物，但是这两种方法存在各自缺点：前者表现为对病人副作用大，且不同患者的应答效率存在较大差异，后者表现为在治疗过程中，容易出现耐药毒株。同时这两种方法均无法彻底治愈慢性乙肝。

慢性乙肝患者久治不愈的重要因素之一是HBV感染的肝细胞内持续存在乙肝病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。在临床治疗过程中，干扰素或/和核苷类似物均不能清除cccDNA，而cccDNA的彻底清除是治愈乙肝的金标准，因此急需开发出针对cccDNA清除的策略。

本申请的发明人经实验研究发现，使用白介素21，以及构建的IL-21的过表达质粒，对乙型肝炎病毒慢性化感染模型进行干预，可以显著提高乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的转换率，同时能显著降低血清中乙型肝炎病毒的DNA载量，由此发现并公开了白介素21(IL-21)在制备抗乙型肝炎病毒药物中的新用途(具体参见申请公布号为CN108324930A的发明专利申请文件)；然而，注射质粒的治疗方法不能运用于慢性乙肝患者。

因此，本领域希望能够开发更适合于慢性乙肝患者的相关治疗药物。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种应用于慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的组合物，其中，该组合物包含白细胞介素-21(IL-21)和乙肝表面抗原(HBsAg)，其中，白细胞介素-21与乙肝表面抗原的质量比为1：100～1：300。

本发明另一方面提供了一种应用于慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物的制备方法，其中，

该制备方法包括以下步骤：

步骤1)：取慢性乙肝患者的脾脏细胞，体外培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，获得细胞浓度为1x10⁸～3x10⁸个/ml的细胞培养液；

步骤2)：将如权利要求1所述的组合物加入到步骤1)所获得的细胞培养液中进行刺激，加入后的白细胞介素-21浓度为80～120ng/ml，加入后的乙肝表面抗原的浓度为10～20μg/ml，刺激培养50～70小时；

步骤3)：从步骤2)所获得的培养液中离心去除白细胞介素-21和乙肝表面抗原，将刺激后的脾脏细胞重悬于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，获得细胞浓度为0.5x10⁸～1.5x10⁸个/ml的细胞培养液，即为所述应用于慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物。

本发明再一方面提供了上述的组合物，或者如上述制备方法获得的药物，在制备治疗慢性乙肝的体外细胞免疫疗法的药物中的应用。

优选的，所述慢性乙肝是由乙型肝炎病毒引起的。