[发明专利]一种温敏性聚合物L64-IDA-Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法

说明书

本发明涉及一种温敏性聚合物L64‑IDA‑Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法，属于分离纯化技术领域。本发明首先制备温敏性的聚合物L64‑IDA‑Cu(II)，然后将其作为捕集剂用于分离纯化菠萝蛋白酶，本发明制备合成的聚合物在温度高于其低临界溶解温度时，会自缔合而形成胶束，既避免结合的酶分子间的相互聚集导致酶活的损失，又能从溶剂中分离出来；当温度低于LCST时，胶束又展开释放菠萝蛋白酶的同时恢复到原始状态，易于将聚合物沉淀析出从而纯化菠萝蛋白酶；该合成物具有很好的重复利用性；并且本发明中使用的分离纯化方法操作简便，酶活损失少且对环境无污染。

技术领域

本发明涉及一种温敏性聚合物L64-IDA-Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法，属于分离纯化技术领域。

背景技术

菠萝蛋白酶，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶，是从菠萝的果茎，叶，皮，芯中提取出来，再应用于各个行业，在食品加工业中，提高烘焙口感，使肉类嫩化。在美容行业中，具有嫩肤，美白祛斑的优异功效。在医药行业，科学家们已经开展了药理学研究调查，研究发现该酶能抑制肿瘤细胞的生长，治疗心血管疾病，还具有消炎作用。

工业生产上对菠萝蛋白酶的制备主要是从菠萝的下脚料中提取，主要的制备工艺有高岭土吸附法、单宁沉淀法、盐析法和沉淀法等。这些方法都普遍存在一些不足之处，如工艺流程较长，原料消耗较多，酶活总回收滤较低等。而且，这些方法通常需要利用有机化学试剂作为溶剂和高温调节，这可能导致目标蛋白的构象发生变化，引发变质。因此，迫切需要开发出更高效，生物相容性好的提取菠萝蛋白酶技术。

发明内容

本发明的目的在于克服目前菠萝蛋白酶提取工艺复杂，酶活损失严重，污染环境等缺陷，提供一种新型的分离纯化菠萝蛋白酶的新方法，该方法具有操作简便，特异性高，分离效果好，酶活损失少，生产成本低，且材料可循环使用等优点。

本发明采取的技术手段如下：

本发明首先提供一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)，即三嵌段聚合物L64（(乙二醇)₁₃(丙二醇)₃₀(乙二醇)₁₃）、亚氨基二乙酸、铜离子鳌合合成的聚合物，记为L64-IDA-Cu(II)。

本发明还提供所述温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，具体方法如下：

（1）三嵌段聚合物L64（(乙二醇)₁₃(丙二醇)₃₀(乙二醇)₁₃）的环氧化：

称量一定量的L64和环氧氯丙烷加入圆底烧瓶，慢慢滴加三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%的三氟化硼BF₃）并于冰水浴（保持在0℃下）搅拌过夜。冰浴，维持搅拌，滴加NaOH，并再次于冰水浴下搅拌约5h。

所述L64和环氧氯丙烷的质量比为15-25：0.5-0.9；

所述三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%BF₃）用量为0.75-1.25mL；

所述滴加的NaOH的量为3-5mL，质量分数为40%。

（2）L64与亚氨基二乙酸（IDA）的偶联（L64-IDA）：

称量一定量环氧化的L64，加入NaOH调节pH后，加入IDA，搅拌条件下水浴；再加入Na₂SO₄，反应物成两相，用分液漏斗收集上相的富L64相，加热再次分成两相；收集下相中L64，用水稀释，并再次分相收集下相，即得到L64-IDA。

所述环氧化的L64用量为15-25g；

所述调节pH7-12.5，所述NaOH的浓度为0.2M；