[发明专利]特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体

说明书

特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学技术领域。本发明提供了利用全细菌SELEX技术（whole bacteria‑SELEX）筛选粪肠球菌适配体的方法，得到35条粪肠球菌特异性适配体序列，并从中优选出Apt10、Apt21、Apt29、Apt34四条与粪肠球菌具有高亲和力的ssDNA适配体序列，可以特异性地和粪肠球菌结合，为粪肠球菌的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰的高特异性检测识别元件。

技术领域

本发明涉及特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，具体涉及对粪肠球菌特异性的新型识别元件ssDNA适配体的筛选，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学技术领域。

背景技术

肠球菌（Enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌，其致病机理主要是通过分泌细胞溶解素、明胶酶等毒性物质侵袭破坏宿主组织细胞，并耐受宿主的非特异性免疫应答，从而引起感染性疾病的发生与发展。随着抗生素的广泛使用，肠球菌的多重耐药性不断增强，特别是耐万古霉素的肠球菌的出现，使肠球菌感染成为重要的公共卫生问题。据2010年中国CHINET细菌耐药监测网显示，肠球菌在尿路感染中所占比例仅次于大肠埃希菌，而在血流感染中居第三位。临床感染的肠球菌以粪肠球菌和屎肠球菌为主，其中粪肠球菌（Enterococcus faecalis）最为多见，约45%~65%。目前，常规的粪肠球菌检测方法主要分为四大类，即微生物学检测法、分子生物学方法、免疫学方法和仪器分析法。然而，这些方法存在灵敏度低、成本高、耗时长、操作繁琐等缺点，不能很好地实现粪肠球菌的快速检测。因此，建立一种高灵敏度、快速检测粪肠球菌的方法是十分必要的。

指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX）是近年来新建立的一种体外筛选技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有10¹³~10¹⁵个不同基元的初始文库中，经过数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。SELEX可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。

发明内容

本发明的目的是通过whole bacteria-SELEX技术，筛选得到能特异性识别和结合粪肠球菌的ssDNA适配体，该适配体是粪肠球菌的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。

本发明的技术方案，特异性结合粪肠球菌的ssDNA适配体，选自序列表Apt1~Apt35所示序列的一种或多种，包括含有Apt1~Apt35所述序列的ssDNA。

其中，序列表Apt1~Apt35在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3’。其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。

在序列表中，优选序列Apt10、Apt21、Apt29和Apt34所示的序列。具体如下：