[发明专利]一种重组醛酮还原酶突变体及应用

说明书

本发明公开了一种重组醛酮还原酶突变体及在不对称还原6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用，重组醛酮还原酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸第29位、28位进行单突变或多突变获得的。本发明制备的醛酮还原酶突变体KmAKR‑Y296W/W297H/K29H/Y28A的比酶活较对照组KmAKR‑Y296W/W297提高了1.15倍，最大底物6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯投料量达到200g/L，底物转化率大于99％，产物de_p值始终保持在99.5％以上。产物的浓度为549mM，时空产率达到670.5g/L d。

技术领域

本发明涉及醛酮还原酶KmAKR突变体构建，开发醛酮还原酶重组菌和酶在阿托伐他汀侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成方面的应用。

背景技术

阿托伐他汀钙(7-[2-(4-氟苯基)-3-苯基-4-(苯胺基甲酰基)-5-(2-丙基)吡咯-1-基]-3,5-二羟基庚酸钙)属于第三代合成他汀类药物，钙盐的商品名具有高效的降脂功效，安全和长期临床益处，可降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。到目前为止，阿托伐他汀钙的累计销售额超过1000亿美元，是制药工业史上最成功的单一药物品种。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙的关键手性二醇中间体，具有两个手性中心，因此，研究光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的手性合成方法学和合成技术具有重要意义。已有的文献报道6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯合成方法主要包括化学催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原和氧化还原酶差向选择性还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。化学催化剂硼烷催化还原存在能耗高，转化率低，生产成本高等缺陷。与化学催化剂相比，酶具有更高效率的催化性能，生物还原具有立体选择性高，副产物少，反应条件温和，环境友好等优点。

由于蛋白质工程的发展，生物催化已广泛应用于工业化生产。半合理设计是一种成熟的蛋白质工程策略，利用蛋白质序列、结构和功能的信息，以及计算预测算法来预选有可能性的突变位点。在无法建立高通量筛选方法的情况下，半合理设计可以减少筛选工作量。因此，在本发明工作中，我们选择半理性设计进行KmAKR改造。

我们从一株耐热马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus ZJB14056基因组中克隆出一种新的醛酮还原酶(KmAKR)编码基因kmakr。通过定点突变技术获得了一株优势突变株KmAKR-W297H/Y296W已在专利申请(201710282633.X)中公开，能够在不添加外源型辅酶NADPH的情况下，4.5h内完全转化75g/L的底物，但发现该酶的活力和底物投料量还有提升空间突变体。因此，本发明借鉴已报道的醛酮还原酶晶体结构信息，运用同源建模和分子对接技术手段，确定KmAKR-W297H/Y296W的空间结构、酶活性中心附近的氨基酸位点，通过半理性设计提高醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化活力及底物投料量，构建具有工业应用价值的突变酶及催化工艺。

发明内容

本发明目的是针对现有醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原活性不高及底物投料量低的问题，提供一种立体选择性醛酮还原酶突变体及利用该醛酮还原酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成，催化剂活性提高1.15倍，底物投料量提高至200g/L。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶突变体，所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第29位、28位进行单突变或多突变获得的，优选突变体为下列之一：(1)第29位赖氨酸突变为组氨酸或精氨酸；(2)第28位酪氨酸突变为丙氨酸或组氨酸；(3)第29位赖氨酸替换成组氨酸且第28位酪氨酸替换成丙氨酸。