[发明专利]以幼孢子囊群诱导的GGB途径的华南紫萁组培繁殖方法

说明书

以幼孢子囊群诱导的GGB途径的华南紫萁组培繁殖方法，包括外植体的选择及表面消毒、绿色球状体的诱导、绿色球状体的增殖、绿色球状体的分化、分化幼苗的壮苗及生根培养和华南紫萁组培苗的炼苗移栽等步骤，为通过组织培养途径繁育优质华南紫萁商品种苗提供了方法和途径，成功建立了以华南紫萁未完全展开叶上的幼孢子囊为外植体的组培繁殖方法，通过GGB途径诱导获得华南紫萁种苗，诱导时间短，诱导率高，且可周年生产，不受季节限制，解决了常规的孢子繁殖对环境要求高，且收集孢子受限等的问题。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种以幼孢子囊群诱导的GGB途径的华南紫萁组培繁殖方法。

背景技术

华南紫萁（Osmunda vachellii Hook.），真蕨目紫萁科紫萁属蕨类植物，产于亚洲亚热带湿润地区, 常野生于山地、草丛或溪边。该种兼具厚囊蕨纲和薄囊蕨纲的特点，是薄囊蕨类中最原始的类群，也是现存的厚囊蕨纲和薄囊蕨纲之间过度类型的少数种类之一。

华南紫萁为陆生蕨类，植株高1-2m，根状茎粗壮，形成圆柱形主轴。叶簇生顶部，厚纸质，两面无毛，呈黄绿色，略有光泽；叶柄长15-35厘米，坚硬；叶片长圆形，长30-80 cm，宽15-30 cm；羽片具短柄，着生于叶轴上，披针形或线状披针形，长15-20 cm，宽1.5 cm，顶端长渐尖，基部狭楔形，近全缘。株型美观，形似苏铁，叶姿态优雅，颇具观赏价值。其嫩苗、根茎、叶柄残基等可入药，具有清热解毒、止血生肌，健脾利湿，舒筋活络等功效。

随着生态文明建设的不断深入，观赏蕨类植物作为一种优新园林植物资源，已逐渐成为当今风景园林建设中的新宠儿。华南紫萁树形美观，作为现存少有的木本蕨类之一，在蕨类植物造景和生态绿化中的作用举足轻重，可供庭园、绿化带栽植或室内盆栽观赏，终冬不凋。但是，它们的自然繁殖能力差，且伴随着生态环境的恶化和采挖现象时有发生，野生种群面临大威胁。该物种的濒危性及其野生繁育的局限性是制约其深入开发和利用的重要因素。积极开展华南紫萁的人工快速繁殖研究，不但可以减少野外乱采滥挖现象，保护野生种质资源，而且可以扩大其园林绿化应用范围，提高观赏蕨类植物在园林中的比重，丰富园林绿地的生态内涵。

华南紫萁的人工繁育主要以孢子繁殖为主。该方法对繁殖环境条件要求高，周期长，且孢子获得受季节限制，成苗率有限。利用组织培养技术可以有效地解决上述问题。但目前，蕨类植物组培研究的瓶颈主要集中在以下两个方面：一是多数蕨类植物直接从地栽的活体植株上很难获得合适的外植体，诱导难度极大；二是以绿色球状体（简称绿球体，Green Globular Body，GGB）途径进行组培繁殖（外植体一绿色球状体一植株）时，绿球体的诱导是关键技术。蕨类植物绿色球状体是指由蕨类植物外植体诱导得到的由众多绿色颗粒组成的球状体，其本质是分生组织集合体，接种于分化培养基上可以获得大量蕨类植物幼苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术之不足，提供一种以幼孢子囊群成功诱导绿色球状体，获得大量华南紫萁种苗的方法，为其快速繁殖和规模化生产奠定基础，以满足生态及市场需求。

本发明是以如下技术方案实现的：以幼孢子囊群诱导的GGB途径的华南紫萁组培繁殖方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择及表面消毒：选取带有幼孢子囊群的华南紫萁未完全展开叶片，轻轻去除表面污垢，经流水冲洗干净后转入75％乙醇浸泡20 s，再用0.1％氯化汞振荡清洗2-4 min，无菌水冲洗5-7次，得华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体；

（2）绿色球状体的诱导：将步骤（1）获得的华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体首尾切除，剪成2 cm小段，按照极性方向小心接种到GGB诱导培养基中；将接种好的材料置于光照培养架上进行培养；培养7-10天，在培养基表面可以观察到很多从孢子囊群中散落下来的绿色孢子，继续培养2周，孢子逐渐膨大形成华南紫萁绿色球状体；