[发明专利]一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T为表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞或表达CD133-CAR的同时分泌IL12细胞因子的CAR-T细胞，所述的CD133-CAR包含scFv区域，该scFv区域用于识别CD133抗原，该scFv区域序列为经过优化的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的分泌型靶向CD133的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；

（2）将携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；

（3）从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；

（4）将步骤（2）所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞；

（5）将步骤（4）所得细胞体外培养；

（6）将步骤（5）所得细胞大量扩增；

（7）收集表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是二代或者三代的慢病毒转基因质粒。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒；所述的重组慢病毒质粒是靶向CD133抗原且分泌IL12细胞因子的慢病毒转基因质粒，重组慢病毒质粒依次包含CMV启动子序列、CD133单链抗体、C-myc表位标记、CD8嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、NFAT启动子序列、IL12细胞因子序列；步骤（2）中所述的重组慢病毒载体将靶向CD133抗原的嵌合抗原受体表达在T细胞表面，同时能够分泌IL12细胞因子。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒；所述的重组慢病毒质粒是靶向CD133抗原且分泌PD-1抗体的慢病毒转基因质粒，重组慢病毒载体依次包含CMV启动子序列、CD133单链抗体、C-myc表位标记、CD8嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、EF1启动子序列、IL2SS序列、PD-1抗体序列；步骤（3）中所述的重组慢病毒载体将靶向CD133抗原的嵌合抗原受体表达在T细胞表面，同时能够分泌PD-1抗体。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的辅助质粒有三个，分别为pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pMDLg-pRRE，所述的宿主细胞为293FT细胞或293T细胞。

8.一种混合制剂，包括如权利要求1所述的表达CD133-CAR的同时分泌PD-1的CAR-T细胞或表达CD133-CAR的同时分泌IL2的CAR-T细胞。