[发明专利]基于碱基编辑靶向LewisY的CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明属于免疫治疗领域，公开了一种PD‑1基因敲除且靶向Lewis Y的CAR‑T细胞，并公开了通过BE‑Plus系统进行基因敲除的同时将表达LewisY‑CAR的质粒载体导入T细胞的制备方法，以及该CAR‑T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明公开的PD‑1基因敲除且靶向Lewis Y的CAR‑T细胞可以解除PD‑1/PD‑L1的抑制通路，有助于改良靶向LewisY的CAR‑T细胞的功效，且制备工艺简单，在肿瘤的细胞治疗中拥有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞及其制备方法和其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。由于其卓越的疗效和创新型，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。近年来肿瘤的免疫疗法已经成为当前肿瘤治疗的热点。其中嵌合抗原受体T细胞技术（Cheimetic Antigen Receptors-T cell，CAR-T）是一种新型的过继性细胞疗法（Adoptive cell transfer therapy，ACT），该疗法将患者的T细胞在体外修饰增殖后回输到患者体内，通过T细胞表达的特异性受体，靶向性的识别肿瘤细胞，且CAR-T细胞在体内能显示出较强的杀伤活性和持久性。

Lewis Y抗原是结合Ⅱ型血型寡糖链的四糖结构，Lewis Y抗原主要表达于胚胎发生期，在成人其表面表达则限于粒细胞和上皮表面。研究发现：在70-90%的上皮组织的癌细胞中发现了Lewis Y的过表达。Lewis Y作为靶结构的优点为表达抗Lewis Y嵌合受体的T细胞可能潜在的靶向表达Lewis Y的广泛恶性肿瘤。有研究表明以Lewis Y为靶点的LewisY-CAR转导的T细胞对RPMI 8226-13细胞和原代MM细胞表现出特异性的增殖杀伤活性。SPeinert （‎2010）的研究进一步证实了表达抗Lewis Y嵌合受体的T细胞在体外的特异性和其体内抗肿瘤活性，展现出CAR-T细胞靶向治疗肿瘤的另一个前景。

CAR-T细胞的组成包括抗原结合区、跨膜铰链区和胞内信号区三个部分。胞外区主要是单克隆抗体的单链可变区序列（scFv），可识别肿瘤特异性抗原；胞内区主要是T细胞受体CD3的ζ链或者是免疫球蛋白Fc受体的γ链（FcRγ），向细胞内转导胞外识别的信号。一般通过电穿孔或病毒转导，使嵌合抗原受体分子表达在T细胞表面形成CAR-T细胞，使其可以特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并裂解肿瘤细胞。

虽然CAR-T细胞在血液恶性肿瘤中显示出了很好的疗效，但是在实体瘤方向的应用仍然存在比较大的局限性，比如缺乏肿瘤特异性抗原，或者难以到达肿瘤部位，以及易受肿瘤微环境影响丧失功能或活性。肿瘤微环境的免疫逃逸机制主要是通过PD-1/PD-L1抑制通路，导致T细胞不能杀伤肿瘤细胞。通过靶向敲除PD-1基因，可以解除PD-1/PD-L1的抑制通路，有助于改良靶向Lewis Y的CAR-T细胞的功效。此外，将CAR-T细胞进行PD-1基因敲除，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。

中国专利CN201410077474.6提供了一种快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过提供精准特异性靶向PD-1基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术，达到特异性敲除PD-1基因的目的。但是，CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患。

为了解决CRISPR-Cas9所显示出的缺陷和局限性，本发明提供一种更加精确特异性更强的针对T细胞PD-1基因敲除的方法及其应用，并提供相应的技术方案，达到制备目的免疫细胞PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞的技术方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，该CAR-T细胞能够免受肿瘤微环境的抑制，特别是PD-1通路介导的免疫抑制，且具有超越一般靶向Lewis Y的CAR-T细胞的杀伤能力。