[发明专利]一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序

说明书

本发明涉及一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序。所述细菌真菌菌落PCR通用程序为，将细菌、真菌分别接种于相应的培养基上进行培养，培养基长出明显肉眼可见的菌落为实验可用菌落；通过机械研磨破碎微生物细胞，在细胞破碎沉淀物中仅加入TE缓冲液后即得到DNA模板，所得DNA模板可直接用于PCR扩增；除引物不同外，细菌、真菌后续PCR扩增的反应体系、反应程序完全相同。本发明方法安全易操作，成功率高，结果可靠，可用于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母和丝状真菌特定片段的扩增，简化了菌落PCR的步骤，降低了时间成本和经济成本，适合应用于大批量、多类别环境微生物的快速鉴定。

技术领域

本发明涉及一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序。

背景技术

PCR技术已广泛应用于生物学、医学、考古学等各个领域的基因研究和分析。PCR快速鉴定微生物特定DNA序列是常规分子生物学研究的基本要求，而菌种模板DNA的成功提取是PCR技术的基础。

常规PCR扩增前的菌种模板DNA制备需要经过破壁、抽提、沉淀、纯化等步骤，操作繁琐、耗时长，反复操作会造成DNA的损失，而且用于DNA抽提的酚、氯仿等试剂不利于操作者的身体健康。菌落PCR是一种利用PCR技术筛选特定DNA序列的单个菌落的方法，由于不需要从大量微生物培养物中分离纯化基因组DNA，菌落PCR可以快速、简单的确定少量菌所包含特定的DNA序列，除了微生物分类鉴定外，菌落PCR还经常用于基因扩增、重组整合子的鉴定和质粒构建、医学诊断等领域。

目前，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、酵母、丝状真菌的菌落PCR方法已有报道[Woodman,Michael E.Direct PCR of intact bacteria(colony PCR).[J].CurrentProtocols in Microbiology,2008,Appendix 3:Appendix 3D.]，[Amberg D C,Burke DJ,Strathern J N.Yeast colony PCR.[J].Csh Protocols,2006,2006(1).]，[张晓利,吕雪莲,沈永年,等.菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究[J].中华皮肤科杂志,2011,44(8).]，这些方法主要是在一定的缓冲液中重新悬浮微生物细胞，然后进行必要的煮沸、冷冻步骤以促进细胞裂解释放DNA，但每种方法只对特定类别的微生物有效，细菌、酵母、丝状真菌的菌落PCR操作参数各有不同，不具有广泛适用性，目前国内尚无细菌真菌通用的菌落PCR的报道。此外，由于真菌细胞外层有较厚且坚韧的细胞壁，单纯的热力作用难以使细胞裂解，因此真菌特别是丝状真菌菌落PCR效果普遍不理想。实际上目前大部分实验室采用液氮冷冻干燥研磨破碎丝状真菌细胞壁，但这种方法步骤繁琐，液氮研磨费时费力，容易冻伤操作人员，除此之外，细胞液氮研磨后往往需要用到有毒的有机试剂进一步提纯，不利于操作人员健康安全。

发明内容

本发明提供一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序，其操作简单，广泛适用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、酵母和丝状真菌特定DNA序列的扩增，扩增阳性率很高。

所述一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序为，将细菌、真菌培养物分别接种于相应的培养基上，进行培养，培养基上长出明显肉眼可见单菌落时，作为实验可用菌落，制备DNA模板，进行PCR扩增。

上述培养基和培养温度，为公知常识，一般细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，在37℃下培养；一般真菌采用PDA培养基，在28℃下培养。

DNA模板的制备方法为：

细菌、真菌DNA模板的制备方法完全相同，操作步骤如下：用无菌移液器吸头或灭菌牙签直接从待测培养皿中挑取实验菌落，并移入装有无菌水的离心管中，向离心管中加入少量高压灭菌的不锈钢研磨珠后放入研磨仪中研磨，研磨后取研磨液离心，除去离心上清液后加入少量TE缓冲液重悬，所制重悬液即可用作细菌真菌菌落PCR通用程序的DNA模板。