[发明专利]一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法

权利要求书

1.一种高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：

将Bt-cry1C基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切、PCR和测序验证后，获得Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体pYY25质粒；

用金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到阳性抗性芽，再经过叶片抗性再生后，获得同质化的转Bt-cry1C基因山新杨植株；

所述高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法具体包括：

步骤一，质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体的构建：以pBar13-cry1C质粒DNA为模板，用cry1C-F和cry1C-R这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增得到cry1C基因片段，然后把此基因片段克隆到平末端载体-Blunt Simple上构建质粒pYY23；cry1C-F的序列为SEQ ID NO：2；cry1C-R的序列为SEQ ID NO：3；

用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切pYY23质粒DNA后得到的小片段与用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把经测序验证正确的重组子命名为pYY25，即为质体转Bt-cry1C基因山新杨质体转化载体；

步骤二，转Bt-cry1C基因山新杨植株的获得和分子鉴定：用0.6μm的金粉包裹pYY25质粒DNA通过基因枪法导入山新杨基因组中，在含30mg/L壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选抗性芽，阳性芽在含30mg/L壮观霉素的PaSIM2培养基上经过2-4轮的抗性筛选得到同质化的阳性芽，通过Southern blot检测阳性芽和达到同质化的阳性芽；通过筛选获得了2株同质化的阳性芽，把此阳性芽进一步的培养得到质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗；Bt-cry1C蛋白序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，步骤二后，还需进行：质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析:把得到的2株同质化的质体转Bt-cry1C基因山新杨组培苗经过炼苗后，移栽到温室中生长。

3.如权利要求2所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，质体转Bt-cry1C基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析后，还需进行：

转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析:用Bt-cry1C蛋白ELISA检测试剂盒检测山新杨野生型和转基因山新杨植株上幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片、根、表皮和木质部的样品中Bt蛋白的含量。

4.如权利要求3所述的高抗白蛾质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，转Bt-cry1C基因山新杨植株中Bt-cry1C蛋白的定量分析后，还需进行：转Bt-cry1C基因山新杨抗虫试验:山新杨野生型叶片和转Bt-cry1C基因山新杨叶片对美国白蛾的喂食试验。