[发明专利]一种敲除大肠杆菌PTS系统提高L-苏氨酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种敲除大肠杆菌PTS系统提高L‑苏氨酸产量的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。本发明通过敲除菌株的PTS系统，使菌株不用过表达其他糖转运基因就能快速摄取葡萄糖，提高葡萄糖的利用率。应用本发明的方法构建的突变菌WMZ016/pFW01‑thrA*BC‑rhtC发酵24h葡萄糖即可利用完全，发酵12h的苏氨酸产量可达4.40g/L；发酵24h苏氨酸产量可达7.48g/L；发酵36h苏氨酸产量可达7.14g/L，比出发菌株提高了7～12.35倍，具有很大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种敲除大肠杆菌PTS系统提高L-苏氨酸产量的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。

背景技术

L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。

L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。

在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂。

目前大部分产苏氨酸的改造菌都是通过诱变筛选和基因工程代谢改造而来的，通过诱变得到高产菌的工作量巨大，太过盲目；现有通过目的明确的基因工程改造苏氨酸生产菌大部分都是过表达苏氨酸合成关键基因thrA、thrB、thrC、rhtA、rhtB、rhtC；敲除lysA和metAJ基因以及过表达aspC、ppc增加苏氨酸合成前体；敲除tdh、ilvA基因降低苏氨酸分解代谢。这些经典策略是建立在对具有相关代谢途径的菌株进行的改造。

发明内容

本发明旨在通过基因工程改造，实现野生大肠杆菌苏氨酸产量从无到有的积累。

本发明以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌株，构建了PTS缺陷、乙醛酸循环加强、TCA循环加强的宿主菌株，并转入了表达载体pFW01-thrA*BC-rhtC，通过代谢改造，把一株不产苏氨酸的野生大肠杆菌，改造成PTS系统缺陷但能快速利用葡萄糖，并能提高苏氨酸产量的基因工程菌。

本发明的第一个目的是提供一株产L-苏氨酸基因工程菌，所述工程菌是以野生型大肠杆菌为基础，共表达了thrA*BC和rhtC基因，敲除了iclR基因，敲除了crr、ptsG、ptsH、ptsI中的任一基因、并用强启动子trc替换了gltA基因原始启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌是以野生型大肠杆菌为基础，共表达了thrA*BC和rhtC基因，敲除了iclR和crr基因、并用强启动子trc替换了gltA基因原始启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌是以野生型大肠杆菌E.coli MG1655为基础。

在本发明的一种实施方式中，所述thrA*BC的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述rhtC基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种构建所述的重组菌的方法：运用CRISPR基因编辑技术，敲除了大肠杆菌基因组上的crr、iclR基因，以及用强启动子trc替换掉gltA基因原始启动子，再转入连接有thrA*BC和rhtC基因的质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述thrA*BC的序列如SEQ ID NO.1所示。