[发明专利]家蚕多肽功能研究方法及其应用

说明书

本发明公开了家蚕多肽功能研究方法及其应用，所述方法通过先敲出体内编码多肽的基因，然后利用多肽通过体液运输的特性，通过活体注射补充多肽来回复因基因敲出而出现的表型变化，从而筛选出起作用的多肽，过程中也明确了该多肽的功能，该方法尤其对蛋白前体能切割形成多种多肽的多肽功能研究有很好的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种多肽功能研究方法，具体为采用向相应基因缺失型突变体体腔注射多肽溶液的手段研究家蚕多肽功能，及该方法在其他昆虫多肽功能研究中的应用。

背景技术

由两个及两个以上α氨基酸通过肽键连接形成的化合物称之为多肽。在所有细胞中均能合成多肽，发现的多肽种类也有数万种，是生命活动不可或缺的重要组分，涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个生理过程，多肽功能也是多方面的，如：营养平衡作用、抗溃疡、抗风湿、类胰岛素作用、降血脂、调节血压、提高免疫、抗菌、抗病毒、抗衰老等方面作用。所以多肽具有作用领域广、活性高、分子量小、含量低等特点。在众多多肽中，有些是通过高效液相色谱、质谱和化学手段等分离纯化得到，有些是通过生物信息学方法预测得到，有些是利用高通量测序技术获得，因此很多多肽并不知道其在生理过程中发挥何种作用，这就需要对多肽进行功能探索。此外，多肽通常由蛋白质前体切割而来，释放到血液循环系统，输送到目标组织发挥作用。

多肽一般通过分离纯化或合成获得后再进行功能研究，常用分离纯化方法有盐析法、超滤法、电泳法、离子交换色谱法、亲和层析法、毛细管区带电泳法、超速离心法等，而化学合成主要有液相化学合成法和固相化学合成法。进行功能研究时有多种方式：1、将组织用多肽溶液处理，观察和记录其生理反应，从而判断其功能；2、从基因层面着手，通过研究编码多肽的基因研究其功能；3、通过生物信息学比对，以明晰功能的多肽来判断同源肽的功能；4、活体注射多肽，观察相关生理变化，该方法主要用于哺乳动物的研究，尤其作为代替人的模式动物鼠的多肽功能研究。在多肽的研究中，多采用离体器官研究法和同源性比对法研究多肽功能，如用合成的滞育激素保育卵巢，用合成的FMRFamide溶液孵育离体心脏，研究其对心脏的影响等。当很多物种基因组测序完成以后，开始在基因组层面进行多肽挖掘，其中存在同源多肽且在其他物种中功能已知的多肽，则可以对其功能进行预测。在基因水平研究多肽功能主要通过RNAi或者基因组变异来敲出编码多肽的基因，通过表型研究多肽功能。

上述方法在多肽功能研究中具有重要作用，却存在很多缺陷，首先得到的结果并不准确(离体器官研究法和同源性比对法)，其次操作过程对多肽种类有限制，有些多肽可能没法在离体器官中研究其功能，最后是在进行基因功能研究时，若基因编码的蛋白前体能切割形成多种多肽时，无法判断具体是哪种多肽在生理过程中起作用。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明提供了家蚕多肽功能研究方法及其应用，通过先敲出体内编码多肽的基因，然后利用多肽通过体液运输的特性，通过活体注射补充多肽来回复因基因敲出而出现的表型变化，从而筛选出起作用的多肽，过程中也明确了该多肽的功能，该方法尤其对蛋白前体能切割形成多种多肽的多肽功能研究有很好的效果。

技术方案：家蚕多肽功能研究方法，所述方法包括以下步骤：

第1步、获取家蚕编码多肽蛋白质前体的基因缺陷型突变体；

第2步、根据多肽切割规则及文献报道预测步骤(1)中多肽的种类；

第3步、对步骤(2)预测的多肽进行编号，并合成多肽，配制成多肽溶液；

第4步、家蚕发育至4龄起蚕时注射多肽溶液；

第5步、注射后饲养至5龄起蚕时，观察家蚕表型变化。

优选的，第4步中，4龄起蚕注射步骤为：

(1)将微量注射器高温高压灭菌，烘干后备用；