[发明专利]一种基于固相萃取柱上衍生化的米诺膦酸在血浆样品中的前处理方法及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于固相萃取柱上衍生化的米诺膦酸在血浆样品中的前处理方法及检测方法，属于生物分析领域。本发明提供的检测方法包括以下步骤：先将含有米诺膦酸的血浆样品进行前处理，再采用液相‑质谱联用方法检测血浆中米诺膦酸的浓度，所述前处理包括如下步骤：将含有米诺膦酸的血浆样品向活化后的固相萃取柱进样，淋洗后加入衍生化试剂进行柱上衍生化反应，收集反应液进行氮气吹干、复溶后，取上清直接进样。本方法弥补了米诺膦酸因其极性的原因而无法进行液相分析的缺陷，与已有的衍生化法相比大大减少了血浆的用量，简化了样品前处理步骤。

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种血浆中米诺膦酸的柱上衍生化的前处理方法 以及血浆中米诺膦酸浓度的检测方法。

背景技术

米诺膦酸是在一种新型杂环双膦酸类化合物，用于治疗骨质疏松症以及由骨质疏松症 和恶性肿瘤引起的高血症，通过抑制破骨细胞内焦磷酸法呢酯(FPP)合成酶活性，抑制破 骨细胞的骨吸收，降低骨转换，起到防治骨质疏松的效果。

米诺膦酸片作为一种口服制剂，给药剂量主要为1mg，其在人体血浆中含量低，C_max为200pg左右。在生物样品分析中，需要考察其半衰期的血药浓度，线性的最低定量下 限应该在C_max的1/10到1/20，故需要开发一种高效，灵敏的检测方法来检测人血浆中的 米诺膦酸含量。

之前的研究报道了一种柱上衍生化HPLC-MS/MS方法，该方法的LLOQ为10pg/ml，但该方法单次使用血浆量为1mL，使用6cc/150mg的WAX固相萃取柱，方法步骤多，耗 时，对于样本量大的生物分析试验来说并不适用。

现需要开发一种高灵敏的，更易于操作的高通量HPLC-MS/MS方法并用于药物代谢动力学研究。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种基于固相萃取柱上衍生化的米诺膦 酸在血浆样品中的前处理方法，可以提高了样品测定的灵敏度，解决了生物样品高通量分 析的问题。

本发明的另一目是提供一种采用上述前处理方法检测血浆中米诺膦酸的浓度的检测 方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于固相萃取柱上衍生化的米诺膦酸在血浆样品中的前处理方法，其中，前处理 包括如下步骤：将含有米诺膦酸的血浆样品向活化后的固相萃取柱进样，淋洗后加入衍生 化试剂进行柱上衍生化反应，氮气吹干、复溶后，取上清液进样。

本发明所采用的固相萃取柱为Waters Oasis WAX，进一步可以优选为固相萃取柱为 Waters Oasis WAX(30μm，60mg)。本发明采用的固相萃取柱在进样前，先将固相萃取 柱进行活化，可以依次采用甲醇、纯水进行活化。

本发明中，采用固相萃取柱WAX(Oasis，30μm(60mg)Waters)，使得米诺膦酸 与填充物质能够充分键合，避免了采用其他固相萃取柱在前处理过程中血浆用量过大、反 应时间过长等问题，进而使米诺膦酸发生衍生化反应后从填充物质上洗脱下来。同时本方 法对比了不同类型的固相萃取柱WAX(Oasis，30μm(60mg)Waters)、WAX(Oasis,6cc/150 mgWaters)、以及固相萃取柱Oasis HLB，30μm Waters，结果发现固相萃取柱Oasis HLB， 30μmWaters不能发生柱上衍生化反应，WAX(Oasis，30μm(60mg)Waters)的衍生 化效率为WAX(Oasis,6cc/150mg Waters)的40倍！

本发明选择三甲基硅烷化重氮甲烷(TMS-DAM)作为衍生化试剂。