[发明专利]一种红细胞冷冻保存方法

说明书

本发明提供一种红细胞冷冻保存方法，所述保存方法，包括预处理、滴加部分保护液、加入剩余保护液、浸入液氮。本发明不使用甘油、二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；本发明所述红细胞冷冻保存方法，红细胞冻存180天后，复苏后测定红细胞的指标如下：复苏细胞成活率为91‑92.5%，溶血率为3.14‑3.32%，红细胞变形指数为0.30‑0.33，延长细胞的冷冻保存时间；本发明所述红细胞冷冻保存方法，在液氮保存之前的处理时间短，预处理时间为8‑10min，加入保护液的总时间为20‑25分钟，总共才28‑35分钟。

技术领域

本发明提供一种红细胞冷冻保存方法，属于细胞冷冻保存技术领域。

背景技术

目前临床上长期保存细胞的方法是-80℃或-196℃深低温保存，细胞在低温条件下减缓甚至暂停代谢，从而使细胞达到长期保存的目的，然而，细胞的冷冻保存往往需要加入冷冻保护剂来降低细胞内外液冰晶的产生，避免细胞遭受不可修复的机械损伤和溶质损伤以致细胞死亡。

当前临床输血的红细胞只能来自人体，如何更长期的保存红细胞，特别是稀有血型的红细胞是人们关注的问题。

目前红细胞的冷冻保存主要是采用高浓度的甘油或者二甲基亚砜。但研究发现甘油与DMSO在非冷冻条件下具有细胞毒性，例如，DMSO会抑制细胞繁殖，改变细胞的生物功能等，因此，如果使用DMSO作为细胞冷冻保护剂，必须尽可能缩短它在非冻结状态下与细胞的接触时间，而在细胞使用之前，需要充分冲洗去除DMSO，但是已进入细胞内的DMSO难以彻底清洗掉，DMSO可能已经对细胞的生理功能和活性产生了有害的影响。使用甘油作为红细胞的冷冻保护剂，解冻后需要复杂的洗涤程序去除甘油，并且仍然后有甘油残留在细胞内部，对人体有一定的毒性作用。

现有技术中的传统保护剂一般都是需要进行梯度降温（慢冻）的方法，通常需要一天的时间，繁琐耗时，不仅加剧了有毒冻存保护剂与细胞的接触时间，增加了细胞损伤的机会，还需要多种冷冻设备。另外一旦没有达到“慢冻”的降温速率要求，冻存效率就会显著下降，造成细胞复苏成活率的降低。

CN105685016A公开了细胞冻存保护组合物、该组合物的用途以及细胞冻存的方法，含有一种具有特定结构的两性分子以及细胞用养料成分，该专利避免使用甘油/二甲基亚砜等保护成分，但是该专利将一定数量的细胞加入细胞冷冻保护液中，直接放入液氮中冻存。该方法只适合特定种类的细胞，并不适合红细胞。红细胞即使加入了冷冻保护液，直接放入液氮中冻存，也容易出现细胞损伤，造成细胞溶血率增大、复苏细胞成活率低。

CN100391473C公开了红细胞深低温保存预处理液、冷冻保护液及其应用，为了避免红细胞在液氮冷冻过程受到损伤，导致溶血率增加，复苏成活率降低，该专利需要在预处理液中先进行孵育细胞，在4-40℃水浴中孵育1-4h，细胞回收率达80%以上，溶血率约为20%，红细胞变形指数在0.3左右，但是其只提供了保存1周的效果，本领域技术人员容易判断，采用该专利方法，随着保存时间的延长，细胞的溶血率会逐渐增加，细胞成活率会逐渐降低。并且，该专利预处理的温度较高，时间也较长，会加速红细胞的衰老，缩短其生存周期。

发明内容

为解决现有技术存在的不足，本发明提供一种红细胞冷冻保存方法，实现以下发明目的：

（1）不使用甘油、二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；

（2）提高复苏红细胞成活率，减少细胞溶血率；延长冷冻保存时间；

（3）缩短投入液氮前的处理时间。

为实现上述发明目的，采用以下技术方案：

一种红细胞冷冻保存方法，所述保存方法，包括预处理、滴加部分保护液、加入剩余保护液、浸入液氮。