[发明专利]一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用

权利要求书

1.一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于用胶体金标记抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4作为检测抗体；所述的抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4由杂交瘤细胞株分泌，该杂交瘤细胞株于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14898。

2.如权利要求1所述的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于用胶体金标记抗体包括如下步骤：

1)胶体金溶液制备：将100mL 0.01％氯金酸加热至沸腾，加入1.2mL 1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min后氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

2)取50mL所述胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃将其pH值调至8.2；

3)调好pH值的胶体金溶液中边搅拌边加入2mL IgG浓度为2mg/mL的所述的特异性单抗1D4，搅拌30min；再逐滴加入1mL 25M分子量为20000的聚乙二醇即PEG溶液，再搅拌15min；

4)然后将3)中得到的混合液，于4℃20000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4且含0.4M PEG 20000的0.01M PBS缓冲液悬浮，于4℃20000rpm离心15min，去上清获得沉淀；

5)将沉淀重复用0.01M PBS缓冲液悬浮，离心；

6)用10mL pH 7.5且含2％BSA和0.02％叠氮化钠的PBS缓冲液溶解5)中得到的沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为胶体金标记抗体溶液，4℃保存备用。

3.如权利要求2所述的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于利用所述胶体金标记抗体溶液进行水稻条纹花叶病毒检测的方法具体包括如下步骤：

1)硝酸纤维素(NC)膜准备：用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.3×0.3cm，平整放于干净的滤纸上；

2)样品制备：

a)植物样品的制备：将水稻或小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加2mL的比例加入pH 7.4的0.01M PBS后研钵中继续研磨匀浆1min，得到匀浆液；或者将水稻或小麦植物组织称重后按0.1g植物组织加2mL的比例加入0.01M PBS后于研钵中研磨匀浆2min，得到匀浆液；将匀浆液移至1.5mL离心管中，5000rpm离心3min，或静置5min，上清即为水稻或小麦植物组织的粗提液；

b)传毒介体电光叶蝉样品的制备：一头电光叶蝉放入一个0.5ml的离心管中后加入50-100μL 0.01M PBS，用牙签粗端或200μL枪头捣烂叶蝉呈匀浆液；

3)点样：用移液器吸取水稻或小麦植物组织的粗提液以及电光叶蝉匀浆液各3μL，点样于NC膜的格子中央，室温下干燥10min；

4)封闭：使用按5g脱脂奶粉加100mL PBST缓冲液的比例配制得到5％的脱脂奶粉封闭液，所述PBST缓冲液为含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS；NC膜在封闭液中室温下封闭0.5-1h；

5)洗涤：去封闭液，用PBST缓冲液洗膜2次，每次3min；

6)胶体金标记抗体孵育：NC膜放入用0.01mol/L PBS稀释2000倍的胶体金标记抗体溶液中，于水平摇床上缓慢摇动室温孵育1h；

7)洗涤：去胶体金标记抗体溶液，用PBST缓冲液洗膜4-5次，每次3min；

8)观察判断结果：出现红色斑点的样品为阳性，无色或绿色斑点的样品为阴性。

4.如权利要求1所述的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于其检测感染RSMV水稻病叶灵敏度达到1:40960倍稀释，单位为w/v,g/mL，检测单头携带RSMV电光叶蝉的灵敏度达到1:5120倍稀释，单位为单头/μL。