[发明专利]一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型、建立方法及应用

权利要求书

1.一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型，其特征是，包括向四重突触共培养体系中加入葡萄糖和皮质酮，干预得到；所述四重突触共培养体系包括混合胶质细胞，位于混合胶质细胞上的海马神经元，所述混合胶质细胞包括星形胶质细胞和小胶质细胞的混合细胞。

2.如权利要求1所述的糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型，其特征是，所述混合胶质细胞为星形胶质细胞和小胶质细胞融合至72-75％的混合细胞。

3.如权利要求1所述的糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型，其特征是，所述葡萄糖的浓度为150mM，所述皮质酮的浓度为200μM。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型的建立方法，其特征是，包括如下步骤，首先通过体外培养海马神经元，待细胞生长至5-7天后，备用；待预先接种至蜡柱中的混合胶质细胞生长至72-75％融合后，移去孔内的大部分培养液，仅留部分培养液，将上述接种5-7d的成熟海马神经元的细胞爬片倒扣，置于细胞培养板的蜡烛上，最后共培养3d，即获得四重突触共培养体系；向上述共培养体系中加入葡萄糖和皮质酮，干预18-24h，得到糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型。

5.如权利要求4所述的建立方法，其特征是，所述混合胶质细胞的培育方法为，取适量蜡块置于玻璃注射器内，加热使其熔化后缓慢滴加在12孔培养板内，每孔滴加三处即可，紫外照射30min，备用；

将纯化的星形胶质细胞用PBS缓冲液洗涤细胞两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min，见细胞大部分收缩变圆时终止消化，1000r/min离心5min，弃上清后重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，接种于预包被的12孔培养板内，每孔内加入适量含15％FBS缓冲液的完全培养基，培养箱内继续培养3d备用；

将纯化的小胶质细胞用预冷PBS缓冲液洗涤两遍，加入0.25％胰蛋白酶消化5min后终止消化，离心，重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL，接种于种有星形胶质细胞的12孔培养板内，1d后换用含5％FBS的完全培养基继续培养，得到混合胶质细胞。

6.如权利要求4或5所述的建立方法，其特征是，所述海马神经元的培育方法为，将受孕16-18d SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，取胎鼠全脑，解剖镜下夹取海马，并剥净残余脑膜及血管，剪碎后加胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化，离心，重悬，计数，接种于预先包被L-多聚赖氨酸的细胞培养板中，置于培养箱中4h后全量换成维持液，第3日半量更换维持液。

7.如权利要求4或5所述的建立方法，其特征是，所述星形胶质细胞的培育方法为，将新生3d的SD大鼠乳鼠处死，于75％体积浓度的酒精中消毒3-5min，无菌取出大脑后于预冷D-Hank's液中洗净血丝，仔细去除血管和脑膜，保留皮质，漂洗后剪碎成直径1mm大小并移入15mL离心管中，1000r/min离心5min后弃上清；按2:1加入0.25％胰蛋白酶37℃消化15min，以含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化后反复轻柔吹打，过150目筛网，吸取滤液并离心，再用新鲜培养液重悬，接种于25cm²细胞培养瓶中，于饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中静置培养30min，翻转培养瓶吸出培养液，置于25cm²细胞培养瓶中继续培养；以后每3d换液一次；待细胞长满后将培养瓶置于水平摇床上，220r/min恒温37℃条件下振荡2h，换液以弃除脱落细胞，正常培养条件下再培养30min后，重新置于水平摇床相同条件振摇一次，弃掉培养液，正常培养基继续培养。