[发明专利]用于检测鱼类病毒性神经坏死病荧光定量RT-PCR方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT‑PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分鱼类病毒性神经坏死病与其它种属的菌种或病毒，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测鱼类病毒性神经坏死病的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及海水鱼类疾病检测，属于分子生物学技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对鱼类病毒性神经性坏死病进行荧光定量RT-PCR检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

神经性坏死病毒(Viral nervous virus,VNNV)属于诺达病毒科，病毒粒子无囊膜，呈20面体状，病毒粒子直径一般为25-34nm，其基因组有两条单链RNA组成，一条RNA编码非结构蛋白，另一条编码主要结构蛋白。患病鱼其病理检查可见脊髓、中枢神经系统及视网膜组织大量形成空泡，出现神经性降解。神经性坏死病流行于除南美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，广东、福建、海南及台湾地区是我国鱼类神经坏死病的主要高发区，主要感染石斑鱼、红鳍东方鲍及石鲷等鱼的仔鱼和幼鱼，其死亡率一般在40％～100％。重者在一周死亡率可达100％。患有病毒性神经坏死病的鱼，其鱼体发黑，眼球突出，食欲降低，变得消瘦，出现神经机能障碍，病鱼漂游于水面，在水中打圈或者螺旋状游泳等。病理检查可见，病鱼鳔肿大，神经组织坏死，出现空泡。

感染鱼类神经性坏死病早期可以通过疫苗控制，但是对于鱼类神经性坏死病毒的流行病学研究有限，所以对其疾病防治效果较差。而在我国，集约化水产养殖盛行，其品种单一、养殖密度高，一旦感染上，疾病传播速度非常快，所以对该病害的检测预防显得格外重要。

目前对鱼类神经性坏死病毒检测，主要是基于病理切片法、免疫学、RT-PCR及LAMP技术等各种诊断方法。但是现有的方法都存在不足，基于病理切片法和免疫学检测方法操作复杂、耗时长以及灵敏度低；RT-PCR方法灵敏、准确，但是过程复杂，需要专业人员操作，不适合推广应用；LAMP技术方法快速、简单，但是扩增产物易交叉污染，导致假阳性高，一般只用做疾病初筛，在检测应用中存在一定的局限性。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT-PCR方法，所述方法能够定量、快速、实时检测鱼类神经性坏死病，使VNNV的检测更准确、灵敏、快速和安全。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用荧光定量RT-PCR检测鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值小于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阳性；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值大于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述步骤S2中还包括设计CP基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。

作为一种优选技术方案，所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-GGACCTCGTCGGGAAAGGAG-3')；

SEQ ID NO:2(5'-GACACAGCACTGACACGTTGA-3')。

探针序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3(5'-FAM-CGTCACCTGGTCGGCTGATACTCCTGTA-BHQ1-3)。