[发明专利]一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用，属于生物技术领域。选择报告基因的表达框分别由油菜基因组ALS基因启动子和具有双突变位点的抗ALS抑制类除草剂基因—mALS₃基因以及ALS基因的终止子序列构成。通过农杆菌介导法遗传转化烟草，在转化过程中直接利用磺酰脲类除草剂绿磺隆做再生株的筛选剂，获得转基因烟草。经过PCR检测和抗除草剂性鉴定，表明通过这一途径获得的转基因烟草具有兼抗苯磺隆、双氟磺酰胺和双草醚等多种ALS抑制剂类除草剂的特性，因此，我们认为由油菜ALS基因启动子、抗除草剂基因、和终止子序列构成的表达框可用做选择报告基因表达框，该载体可以用于双子叶植物的遗传转化。

一、技术领域

本发明涉及一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用，属于生物技术领域。

二、背景技术

转基因生物技术源于上世纪的重组DNA技术的发明，1973年美国科学家发明了重组DNA技术，最初转基因技术应用于医药领域，如一些重组疫苗、干扰素等均是转基因产品。进入80年代，转基因技术开始应用于农业育种领域，1983年美国首例转基因植物(烟草和马铃薯)培育成功。自1996年始，转基因作物在全球包括美国、巴西、阿根廷、中国、印度等28个国家商业化应用，至2015年已有26种转基因作物(不包括康乃馨、玫瑰和矮牵牛)的363个转化体获准商业化种植或环境释放，包括以抗除草剂和抗虫为主的玉米、大豆、油菜及棉花等。从1996～2016年，全球转基因作物商业化种植面积从170万公顷增加到1.851亿公顷，增长了110倍，农民收益超过了1500亿美元。但随着转基因植物种类和种植面积的迅猛增加，转基因植物中选择标记基因的生物安全性已成为人们普遍关注的问题之一。

目前在植物遗传转化中广泛应用的标记基因主要有2大类，一类是编码可使抗生素失活的蛋白酶基因，包括新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)(Bevan et al.1983)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)(Ortiz et al.1996)等。抗生素类标记基因只是在植物遗传转化过程中起作用，一旦转基因过程完成，抗生素类标记基因就失去其价值。

此外，抗生素类标记基因存在诸多安全性问题，主要包括环境和食品安全两个方面，(1)可能会转移到微生物中，使得病原菌获得抗生素抗性，从而导致目前临床使用的抗生素失效；(2)可能对人类与动物健康产生负面影响。从大量的试验数据(Bennett etal.2004；Goldstein et al.2005；Ramessar et al.2007)以及多个权威机构和国际组织(NZ ERMA 2000；FAO/WHO 2000；OECD 2000；USA FDA 2001；CAC 2003a；EFSA 2007)发布的风险评估报告来看抗生素标记基因从转基因植物转移至土壤微生物或肠道微生物的风险性非常小，对环境或人类与动物的健康也并不产生危害，但人们还是希望通过一些新的技术手段或开发一些新的安全性标记基因来进一步提高转基因植物的安全性。

在转基因植物中提高其安全性的有效手段之一就是培育无选择标记基因的转基因植物，其中的有效策略是采取一系列措施在转化植株筛选完成后将选择标记基因去除。目前剔除转基因植物选择标记基因的方法主要有4种：共转化法(Komari et al.1996；Luet al.2001)、转座子系统(Cotsaftis et al.2002)、位点特异性重组酶系统(Woo etal.2009)和染色体内重组系统(Zubko et al.2000)。这些方法能完全消除对标记基因的质疑，有利于多基因转化。但是，这些方法也存在耗时长、工作量大、转化率低等缺点，而且受到植物繁殖方式的限制，还有待进一步研究探索。