[发明专利]用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分包纳米虫与其它种属的菌种或虫种，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测包纳米虫的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对包 纳米虫进行TaqMan探针定量检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

包纳米虫为世界动物卫生组织(OIE)规定的必报水生动物疫病之一，目前 可分为四类，即牡蛎包纳米虫(Bonamia ostreae，Bona)、杀蛎包纳米虫(Bonamia exitiosa)、鲁道夫包纳米虫(Bonamia roughleyi)和成孢包纳米虫(Bonamia perspora)。其中，牡蛎包纳米虫是分布最为普遍，造成的危害也最为严重的。 牡蛎包纳米虫是一种有核球形的专性寄生宿主血细胞的寄生虫，常寄生于牡蛎 血液淋巴细胞内，感染后期在牡蛎结缔组织、内脏、消化道和性腺等组织器官 也有寄生。

牡蛎感染包纳米虫后大部分表现正常，不显示临床症状，但生长速度放缓， 机体瘦弱，肉质疏松，心肌肥大，套膜萎缩、溃疡。少部分牡蛎感染包纳米虫 后表现为闭合肌萎缩褪色，出现灰白色小溃疡或穿孔性溃疡，血细胞破裂等症 状。

包纳米虫病的发病与温度有关，温度低时感染包纳米虫也不发病，但当温 度升高，包纳米虫就会爆发，牡蛎感染该病原一般终生携带。该病首先在欧洲 被发现，随后流行于世界。包纳米虫可以通过宿主之间的共栖或接触直接感染， 也能通过牡蛎的呼吸和食物传播。

感染包纳米虫后，目前没有有效的方法进行治疗，只能通过加强疫病监测 与检疫，达到防控该病爆发的概率。国内外学者通过大量的研究，建立了一系 列针对包纳米虫的检测方法，如组织病理解剖法、电镜观察法、雷氏液体巯基 乙酸盐培养法、PCR检测法及LAMP法。但是前三类方法操作复杂、耗时长及 检测灵敏度低，只能对发病明显的牡蛎进行诊断；PCR检测法虽然结果准确， 但检测时间长、操作复杂、无法定量，很难在生产中进行推广应用；LAMP法 虽然检测时间快但假阳性高，达不到精确检测的要求。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量 检测方法，所述方法能够定量、快速、实时检测包纳米虫，使包纳米虫的 检测更准确、灵敏、快速和安全。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用TaqMan探针定量检测检测包纳米虫特异性基因18SrRNA基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的Ct值小 于35时，包纳米虫的检测结果为阳性；当所述包纳米虫特异性基因18SrRNA 基因的Ct值大于35时，包纳米虫的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述步骤S2中还包括设计18SrRNA基因的检测引 物和TaqMan探针的步骤。

作为一种优选技术方案，所述包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的检测引 物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-GATTACGTCCCTGCCCTTTG-3')；

SEQ ID NO:2(5'-TCCACCTAATTCACCTCATTATTCAA-3')。

探针序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3(5'-FAM-CACACCGCCCGTCGCTTCTACC-BHQ1-3)。