[发明专利]一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法

权利要求书

1.一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系，其特征在于，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％-25％。

2.根据权利要求1所述的冻干保护体系，其特征在于，LAMP反应扩增试剂的组成为0.1-4.0U/μL的Bst酶、0.0001-0.0005U/μL的UNG酶、0.4-2.0mmol/L的dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO₄和纯化水中的两种或两种以上。

3.根据权利要求1或2所述的冻干保护体系，其特征在于，冻干保护剂组成按质量比计为：甘露醇3％-12％、聚乙二醇1-5％、苏氨酸0.5％-2％，余量为纯化水。

4.根据权利要求1或2所述的冻干保护体系，其特征在于，反应扩增试剂分为冻干部分试剂以及复溶液，所述复溶液含有分别为0.4-2.0mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO₄中的两种或两种以上。

5.根据权利要求2或4所述的冻干保护体系，其特征在于，所述荧光染料选择SYBRGREEN I或EVA GREEN。

6.根据权利要求1所述的冻干保护体系，其特征在于，冻干体系包括：核酸扩增试剂的冻干试剂1-10μL，以及冻干保护剂混合液5-30μl，终冻干体系约为6-40μL，冻干用离心管为100μL、200μL、500μL、1500μL中的一种。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述的冻干保护体系的方法，包括：

1)核酸扩增试剂配制步骤：

将Bst酶、UNG酶、dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、甜菜碱、荧光染料(SYBR GREENI或EVA GREEN)、MgSO4和纯化水中的两种或两种以上取出置于室温中，待试剂融化后，按照一定的体积比例取出，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用，标明配制日期和保存条件(-20℃)；

2)冻干保护剂配制步骤：

(2.1)将各保护剂使用天平称量一定的质量，分别溶于100ml的纯化水中，震荡混匀，配制为保护液原液，标明配制日期和保存条件；

(2.2)根据冻干保护剂的配方，按照一定的体积比例取出各组分的保护剂原液，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用；

3)冻干用液体试剂的配制

各取出核酸扩增试剂(100个反应)和冻干保护剂(100个反应)相应的体积混合均匀后进行分装(40μL/反应)，离心待用；

冷冻干燥处理包括以下步骤：

1)预冻阶段：液氮1-8min或控制温度-50℃～-40℃，压强为1atm，维持1-3h；

2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持3-6h；

3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；

4)升华阶段：控制温度-35℃～-25℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；

5)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；

6)解析阶段：控制温度0℃～15℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-4h；

解析阶段：控制温度15℃～30℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-4h。