[发明专利]一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法

说明书

本发明提供了地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，采用地衣芽孢杆菌BL312制备，制备方法包括以下步骤：步骤1，将地衣芽孢杆菌BL312涂布、划线培养后接种于改良培养基，培养得到种子液；步骤2，将种子液接种于麸皮培养基，培养得发酵液，将发酵液冷冻离心后取上清液；步骤3，将上清液与硫酸铵的混合液沉析后冷冻离心，并收集沉淀物，将沉淀物溶解于Tris‑HCl缓冲液中，透析后冻干，得到粗酶；步骤4，将粗酶用Tris‑HCl缓冲液溶解后透过滤膜，再经DEAE‑Sepharose Fast Flow离子交换柱分离纯化并透析、冻干后得到地衣芽孢杆菌凝乳酶。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法。

背景技术

凝乳酶作为奶酪加工生产中的关键酶对奶酪的品质有至关重要的影响。随着市场需求的逐年增大，单纯依靠宰杀幼畜提取凝乳酶的方法已不能满足市场的需求，而且大量宰杀幼畜受生长周期及经济因素的限制，加之动物性凝乳酶制成的奶酪很难被素食主义者接受，种种因素促使人们开始不停寻找新的凝乳酶来源。近年来，一些来源于真菌、酵母和细菌的微生物凝乳酶已经在奶酪制作加工中显示了其商业价值，尽管如此，寻找高效、优质的凝乳酶替代品仍然是当今的一大研究热题。由于我国对凝乳酶研究起步较晚，现阶段我国凝乳酶主要依赖进口，只有少数科研单位对产凝乳酶的菌株进行了较系统的研究。因此，筛选高产凝乳酶菌株并高效地得到凝乳酶产品对于我国奶酪产业的发展具有重要意义。

许多微生物，尤其是霉菌和细菌来源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相同或相似的性质，较植物和动物来源凝乳酶，微生物具有生产成本低、酶容易提取、经济效益高和更加广泛的生化多样性的特点。目前，细菌来源凝乳酶的研究较真菌少，但细菌的浸入式发酵较真菌的固态发酵更易控制且物质利用率更高，且通过筛选新菌株和优化发酵条件可克服细菌MCEs具有较低的MCA/PA比值的问题。所以，有关细菌凝乳酶的研究报道逐渐增加。

筛选高产凝乳酶细菌，确定较佳的发酵条件，探索该细菌凝乳酶的性质是否满足后期干酪生产的要求，快速、经济、高效地得到细菌凝乳酶产品成为当今国内外凝乳酶研究的重要方向。有学者研究了一株枯草芽孢杆菌，发现其所产凝乳酶最适作用pH 7.5，培养72h酶活达到最高571.43U/mL；也有学者研究了一株诺卡氏菌，发现其所产凝乳酶最适凝乳pH分别为11.0和7.5，培养40h时凝乳酶活力达到最高24.49U/mg。但目前，天然菌株筛选的地衣芽孢杆菌所产凝乳酶活性都不高，且发酵时间长，纯化过程中酶活损失较大，凝乳酶性质不能更好地满足后期干酪生产的要求。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法。

本发明提供了一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，具有这样的特征，采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL312进行制备，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL312已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15009，保藏时间为2017年12月4号，地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法包括以下步骤：

步骤1，将地衣芽孢杆菌BL312涂布、划线培养14～16小时后接种于改良培养基中，并在温度为37℃、转速为150～170r/min的条件下震荡培养12～14小时后得到种子液；

步骤2，将种子液以5％接种量接种于麸皮培养基中，在温度为37℃、转速为150r/min的条件下震荡培养40～48小时后得发酵液，将该发酵液在4℃的温度下以5000r/min的转速进行10min的冷冻离心后，取上清液；

步骤3，将上清液与硫酸铵混合来得到混合液，将混合液在4℃的温度下沉析2小时后，再在4℃的温度下以7000r/min的转速进行10min的高速冷冻离心，而后收集沉淀物，并将该沉淀物溶解于20mmol/L且pH值为7的Tris-HCl缓冲液中，透析2～4小时后进行冷冻干燥，得到粗酶；