[发明专利]细胞营养液及其制备方法

权利要求书

1.细胞营养液，其特征在于，所述细胞营养液以成纤维细胞为原料制备而成；所述细胞营养液的制备过程具体包括：

1）成纤维细胞的原代分离：取新生儿包皮组织，置于磷酸盐缓冲液中漂洗、浸泡后，去除真皮下附着的结缔组织和毛细血管，然后依次用0.2%中性酶溶液、0.25%的胰蛋白酶消化处理后,加入含10%胎牛血清的完全培养基终止消化；离心,漂洗，重悬后，弃掉上清液，获得原代成纤维细胞；

2）成纤维细胞的扩大培养：将所述原代成纤维细胞计数后按1×10⁵/cm²密度接种细胞至培养瓶中,置入37℃、5% CO₂的培养箱中培养5-7天，获得所述成纤维细胞；将所述成纤维细胞使用磷酸盐缓冲液漂洗一次，0.25%胰酶消化后，按照1:3-4进行传代培养；以后每48-72h传代一次；

3）成纤维细胞的诱导培养：将步骤2）中的20代以内的成纤维细胞，以接种于6孔板中，培养12-18h后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液清洗后，使用UVB照射和/或脂肪干细胞条件培养液处理所述成纤维细胞；

4）收集细胞营养液：将步骤3）处理后的成纤维细胞继续培养48-72h后，收集上清液，获得所述细胞营养液。

2.根据权利要求1所述的细胞营养液，其特征在于，步骤3）中成纤维细胞的诱导采用UVB照射，UVB照射过程为每孔使用2ml 磷酸盐缓冲液清洗一次，然后再加入1ml磷酸盐缓冲液，用UVB 10-100mJ/cm²照射1-4分钟，后弃去磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的细胞营养液，其特征在于，步骤3）中成纤维细胞的诱导过程采用脂肪干细胞条件培养液进行处理，脂肪干细胞条件培养液处理过程为用30%-70%的脂肪干细胞营养液和70%-30%的新鲜培养液混合后， 给成纤维细胞进行换液，然后继续培养；所述脂肪干细胞营养液的准备过程为：将原代2-7代脂肪干细胞按1-3×10⁵个细胞/瓶接种于75cm²培养瓶中，加12-15ml培养液，正常培养三天后收集培养液，用于成纤维细胞的诱导。

4.根据权利要求1所述的细胞营养液，其特征在于，步骤3）中成纤维细胞的诱导采用UVB照射和脂肪干细胞条件培养液同时处理成纤维细胞。

5.细胞营养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）成纤维细胞的原代分离：取新生儿包皮组织，置于磷酸盐缓冲液中漂洗、浸泡后，去除真皮下附着的结缔组织和毛细血管，然后依次用0.2%中性酶溶液、0.25%的胰蛋白酶消化处理后,加入含10%胎牛血清的完全培养基终止消化；离心,漂洗，重悬后，弃掉上清液，获得原代成纤维细胞；

2）成纤维细胞的扩大培养：将所述原代成纤维细胞计数后按1×10⁵/cm²密度接种细胞至培养瓶中,置入37℃、5% CO₂的培养箱中培养5-7天，获得所述成纤维细胞；将所述成纤维细胞使用磷酸盐缓冲液漂洗一次，0.25%胰酶消化后，按照1:3-4进行传代培养；以后每48-72h传代一次；

3）成纤维细胞的诱导培养：将步骤2）中的20代以内的成纤维细胞，以接种于6孔板中，培养12-18h后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液清洗后，使用UVB照射和/或脂肪干细胞条件培养液处理所述成纤维细胞；

4）收集细胞营养液：将步骤3）处理后的成纤维细胞继续培养48-72h后，收集上清液，获得所述细胞营养液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中成纤维细胞的诱导采用UVB照射，UVB照射过程为每孔使用2ml 磷酸盐缓冲液清洗一次，然后再加入1ml磷酸盐缓冲液，用UVB 10-100mJ/cm²照射1-4分钟，后弃去磷酸盐缓冲液。