[发明专利]构建FSCN1基因稳定敲除细胞系方法及质粒或质粒组合和应用

权利要求书

1.一种构建FSCN1基因稳定敲除细胞系的方法，是采用基于CRISPR-Cas9系统构建FSCN1基因敲除细胞系，其特征在于：所述方法以人FSCN1基因第一外显子中的蛋白编码序列和第五外显子中的蛋白编码序列中符合5‘-G-N18-NGG-3或5‘-G-N20-NGG-3’或5’-CCN-N18-C-3’或5’-CCN-N20-C-3’序列规则排列的片段的“N18或N20”为靶序列；N表示A、T、C、G中的任一种，其中“N18”和“N20”分别为18和20个脱氧核苷酸。

2.根据权利要求1所述的构建FSCN1基因稳定敲除细胞系的方法，其特征是：所述靶序列为Seq-No.1和Seq-No.2。

3.根据权利要求1或2所述的构建FSCN1基因稳定敲除细胞系的方法，其特征是：所述方法为如下方法A或方法B或方法C：

方法A，包括如下步骤：

(a1)合成名称为正向单链DNA-1和名称为反向单链DNA-1的2个单链DNA，所述正向单链DNA-1的序列如Seq-No.3所示，反向单链DNA-1的序列如Seq-No.4所示；

(a2)将所述正向单链DNA-1和反向单链DNA-1进行退火反应，得到双链DNA-1；

(a3)将上述双链DNA-1连接到pSpcas9(BB)-2A-puro(PX459)V2.0质粒的限制性内切酶BbsⅠ的切割位点处，得到重组质粒，标记为pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-1；

(a4)将所述pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-1质粒，转染Hep-2细胞，经嘌呤霉素筛选36小时后，采用极限稀释法获得单细胞克隆，从单细胞克隆中鉴定获得FSCN1基因敲除细胞系；

方法B，包括如下步骤：

(b1)合成名称为正向单链DNA-2和名称为反向单链DNA-2的2个单链DNA，所述正向单链DNA-2的序列如Seq-No.5所示，反向单链DNA-1的序列如Seq-No.6所示；

(b2)将所述正向单链DNA-2和反向单链DNA-2进行退火反应，得到双链DNA-2；

(b3)将上述双链DNA-2连接到pSpcas9(BB)-2A-puro(PX459)V2.0质粒的限制性内切酶BbsⅠ的切割位点处，得到重组质粒，标记为pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-2；

(b4)将所述pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-2质粒，转染Hep-2细胞，经嘌呤霉素筛选36小时后，采用极限稀释法获得单细胞克隆，从单细胞克隆中鉴定获得FSCN1基因敲除细胞系；

方法C，包括如下步骤：

(c1)合成名称为正向单链DNA-1，名称为反向单链DNA-1、名称为正向单链DNA-2和名称为反向单链DNA-2的4个单链DNA；所述正向单链DNA-1的序列如Seq-No.3所示，反向单链DNA-1的序列如Seq-No.4所示，正向单链DNA-2的序列如Seq-No.5所示，反向单链DNA-2的序列如Seq-No.6所示；

(c2)将所述正向单链DNA-1和反向单链DNA-1进行退火反应，得到双链DNA-1；将所述正向单链DNA-2和反向单链DNA-2进行退火反应，得到双链DNA-2；

(c3)将上述两个双链DNA分别连接到pSpcas9(BB)-2A-puro(PX459)V2.0质粒的限制性内切酶BbsⅠ的切割位点处，得到重组质粒分别标记为pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-1和pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-2；

(c4)将所述pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-1和pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-2质粒按照质量比为1:1的比例，转染Hep-2细胞，经嘌呤霉素筛选36小时后，采用极限稀释法获得单细胞克隆，从单细胞克隆中鉴定获得FSCN1基因敲除细胞系。