[发明专利]快速、高通量分离收集免疫原特异性B细胞的方法

权利要求书

1.一种快速、高通量分离收集免疫原特异性B细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

步骤一：从经过抗原特异性免疫后的生物中获取无红细胞的细胞悬液；包括：取经过抗原特异性免疫后的动物或人的外周血或单个细胞化后的免疫器官10ml，1500rpm离心5min；弃去上清，加入1×PBS溶液10ml重悬细胞，1500rpm离心5min；弃去上清，快速加入与细胞团同等体积的无菌水，充分混匀；快速加入同等体积的2×PBS溶液，充分混匀；加入1×PBS溶液至10ml，1500rpm离心5min；去上清，加入10ml 1％BSA-PBS溶液混匀，得到所述无红细胞的细胞悬液；

步骤二：使用蛋白交联的方式，制备特异性蛋白-Fc复合物；包括：将抗体Fc片段蛋白编码序列克隆至pcDNA3.1表达载体中；将所述表达载体转染至293T细胞中，培养并筛选出阳性细胞株；将所述阳性细胞株进行培养表达，将细胞培养的上清液5000rpm离心，之后采用0.45μm滤膜过滤，以35ml/min的流速过ProteinA/G柱，用柠檬酸/NaCl缓冲液进行洗脱；过Q-sepharose离子交换柱分离，上柱后缓冲液洗出液即为Fc片段蛋白；将20mg特异性抗原溶于2ml 5mM EDTA/H2O中，得到特异性抗原溶液；将5mg Sulfo-SMCC完全溶于40μlDMSO后，加入160μlPBS溶液，混合均匀，得到Sulfo-SMCC溶液；再将所述Sulfo-SMCC溶液滴入所述特异性抗原溶液中，边加边搅拌，室温放置1小时，得到活化的特异性抗原溶液；将所述活化的特异性抗原溶液在1L 4℃的PBS溶液中透析1小时；更新PBS溶液4℃透析2小时，重复1次，得到透析好的活化的特异性抗原溶液；称取0.5mg Fc片段蛋白，溶于20μlDMSO中，再加入80μlPBS溶液，快速混合均匀，随后立即加入100μl所述透析好的活化的特异性抗原溶液，4℃冰箱过夜或室温反应2小时，得到所述特异性蛋白-Fc复合物；

步骤三：使用商品化标记的protein A/G或二抗琼脂糖珠孵育所述特异性蛋白-Fc复合物，偶联活化琼脂糖珠；利用活化后的琼脂糖珠从所述无红细胞的细胞悬液中捕获免疫原特异性的B细胞群；

所述特异性蛋白-Fc复合物中，特异性蛋白为免疫原，Fc为鼠或者兔抗体的可结晶段；若选择兔原Fc交联时，选择Protein A作为偶联对象；若选择鼠原Fc交联时，选择Protein G作为偶联对象。

2.根据权利要求1所述的快速、高通量分离收集免疫原特异性B细胞的方法，其特征在于：

步骤一中，所述无红细胞的细胞悬液来源于经过抗原特异性免疫后的生物的外周血或单个细胞化后的免疫器官。

3.根据权利要求1所述的快速、高通量分离收集免疫原特异性B细胞的方法，其特征在于：

步骤一中，所述生物为人或动物。

4.根据权利要求1所述的快速、高通量分离收集免疫原特异性B细胞的方法，其特征在于：

步骤三中，还包括将捕获得到的免疫原特异性的B细胞群进行离心、洗涤获得较纯的B细胞的步骤。