[发明专利]一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法

说明书

本发明提供了一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：获得已知包含或可能包含微生物的待测样品；将待测样品点样于单细胞弹射分选仪的样品芯片上；对样品芯片上的微生物进行识别，并将识别为同种属的一定数目的微生物弹射分选至质谱仪的靶板上；通过质谱法鉴定弹射分选出的微生物种属。本发明大大缩短了质谱样品制备所消耗的时间，极大加快了微生物的鉴定速度，且对难以培养的微生物也能进行快速准确的鉴定。

技术领域

本发明涉及一种微生物鉴定方法，特别是一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法。

背景技术

快速、准确的微生物鉴定在临床诊断、环境卫生监控、食品安全分析、生物工业过程检测以及生物医药研究中具有重要意义。特别是在临床感染性疾病的诊断中，感染微生物的快速、无误鉴别对于医生临床用药具有指导作用，与患者生命和预后息息相关。

传统的基于培养与生化分析法的微生物鉴定耗时很长，通常需要几天时间，极有可能因此延误患者治疗。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)近年被应用于临床病原微生物的菌种鉴定中，其根据不同微生物的特征性蛋白指纹图谱进行菌种鉴定。MALDI-TOF MS分析法是通过对被测样品离子质荷比的测定来进行分析的一种分析方法，其原理如下：将样品和基质混合点在金属靶板上形成共结晶，利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质分子吸收能量使样品吸附并使其电离，生成不同质荷比的带电离子；样品离子在加速电场下获得相同动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间质谱分析器进行质量分析；离子的质荷比(m/z)与飞行时间的平方成正比，经计算机处理，绘制成质量图谱，通过软件分析比较，筛选并确定出特异性图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定。例如，公开号为CN103616434A的专利文献就公开了一种质谱鉴定微生物的方法，其对微生物的鉴定准确率达到99％以上，有效的降低了误判和误报的几率，也降低了由于微生物的误判和误报带来的安全事故。

虽然与传统生化分析法相比，质谱法鉴定病原菌的周期在很大程度上缩短了，但由于质谱法对微生物纯度要求较高，对于临床样品等包含多种微生物的检测样品来说，仍需要花费很长时间从待测试样品中培养出纯菌落，此培养过程通常需要18-24小时，对于生长缓慢的微生物甚至需要更长的时间。公开号为CN109060743A的专利文献公开了一种微生物鉴定方法，其利用功能化碳点与微生物之间产生的荧光强度变化形成特征图谱，并通过数学统计方法实现对微生物的鉴别，虽然其不需要较昂贵的仪器，但是此方法对微生物的鉴别种类及准确度有很大限制，且其在实施时同样需要对微生物进行培养，鉴别时间缩短有限。公开号为CN104136908A的专利文献也公开了一种用于鉴定培养物中微生物的光谱手段和方法，其同样需要对获得的生物样品在血琼脂板中进行12至24小时的培养，这就导致了微生物的整体鉴别时间的延长。

此外，更重要的是，对于待测试样品中某些在培养基中难以生长的微生物，就无法使用质谱等方法进行鉴定了，这严重影响了质谱技术对病原菌检测的速度和准确率。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，大大缩短了质谱样品制备所消耗的时间，极大加快了微生物的鉴定速度，且对难以培养的微生物也能进行快速准确的鉴定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：

步骤a：获得已知包含或可能包含微生物的待测样品；

步骤b：将待测样品点样于单细胞弹射分选仪的样品芯片上；

步骤c：对样品芯片上的微生物进行识别，并将识别为同种属的一定数目的微生物弹射分选至质谱仪的靶板上；

步骤d：通过质谱法鉴定弹射分选出的微生物种属。

作为进一步的优选实施方案，所述步骤b还包括如下操作：将微生物从所述待测样品中分离和/或富集；