[发明专利]一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株生产凝胶态黄原胶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以Xanthomonascampestris NK-01为出发菌株，在所述出发菌株中敲除乙酰基转移酶Ⅰ基因gumF和乙酰基转移酶Ⅱ基因gumG，并且过表达酮基转移酶基因gumL；

所述Xanthomonas campestris NK-01的菌种保藏编号为CGMCC No.15155。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述过表达酮基转移酶基因gumL是通过向所述出发菌株中转入包含酮基转移酶基因gumL的多拷贝表达质粒pBBRL实现。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：

1)敲除所述出发菌株中的gumF基因和gumG基因，获得gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)；

2)在步骤1)中所述的gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)中过表达酮基转移酶基因gumL获得基因工程菌。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中敲除所述出发菌株中的gumF基因和gumG基因包括以下步骤：

1.1)以所述出发菌株的基因组为模板，进行PCR扩增获得基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段；所述基因gumF的上游同源臂片段的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示；所述基因gumG的下游同源臂片段的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

1.2)将步骤1)获得的所述基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段通过overlap PCR重组后，连接至自杀质粒pLO3中，获得无痕敲除质粒plO3-FG；

1.3)将步骤2)中所述无痕敲除质粒plO3-FG转入出发菌株中进行gumF和gumG基因的敲除获得gumF和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤2) 中所述过表达酮基转移酶基因gumL包括以下步骤：

2.1)将酮基转移酶基因gumL与载体pBBR1mcs-2连接获得多拷贝表达质粒pBBRL；

2.2)将步骤2.1)中所述多拷贝表达质粒pBBRL转入到所述gumF和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)中获得基因工程菌XC(△FG::pBBRL)。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1.3)中所述的转入为接合转移，所述出发菌株和无痕敲除质粒plO3-FG的数量比为1：(1.5～2.5)；所述接合转移的温度为28～32℃，所述接合转移的时间为8～12h。

7.一种利用权利要求1或2所述基因工程菌生产黄原胶的方法，包括以下步骤：

S1)将所述基因工程菌接种到种子培养基中进行活化获得活化菌液；

S2)将所述活化菌液接种到发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液；所述发酵培养的温度为28～32℃，所述发酵培养的时间为60～84h；

S3)醇沉所述发酵液，收集固相组分为黄原胶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述活化菌液的菌浓度OD₆₀₀为0.4～0.6。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S2)中所述活化菌液的接种量为8～12％(V/V)。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基以1L计，包括以下组分：玉米淀粉，40～60g；鱼蛋白胨，3.5～4.5g；碳酸钙，3.5～4.5g和余量的水。