[发明专利]使用改良的肠杆菌科菌株生产L-色氨酸的方法

说明书

本发明提供了一种生产L‑色氨酸的方法，该方法包括在发酵培养基中培养产生L‑色氨酸的微生物(属于肠杆菌科)；其中产生L‑色氨酸的微生物已通过增强mdfA基因的表达水平或通过增强mdfA等位基因的表达水平而被修饰。

技术领域

本发明涉及使用修饰的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物(其中mdfA基因的表达水平增强)发酵生产L-色氨酸的新方法。

背景技术

L-色氨酸用于人类医学和制药工业、食品工业和动物营养学。

L-色氨酸可以通过肠杆菌科菌株的发酵产生，尤其是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。由于其重要意义，在改进生产方法方面正在不断努力。

方法改进可涉及与发酵技术相关的措施，例如搅拌和供氧，或营养培养基的组成，例如，选择所用的糖或发酵过程中的糖浓度，或后处理产品形式，例如通过离子交换色谱法，或微生物本身的固有性能特性。

在野生型菌株中，严格的调节机制阻止产生超过所述菌株所需的代谢产物如氨基酸并阻止释放到培养基中。因此，从制造商的观点来看，氨基酸过量产生菌株的构建需要克服这些代谢调节。

诱变、选择和突变体选择的方法用于去除所述控制机制和改善这些微生物的性能特性。

由于芳香族L-氨基酸如L-色氨酸的生物合成途径的复杂性以及由于其与细胞中许多其他代谢途径的相互连接，并不总是可以预测菌株的哪些遗传变异或修饰可以实现L-色氨酸产量的改进。

多药转运蛋白MdfA被称为由质子动力驱动的外排泵(Lewinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(4)1667-1672)。在WO2007/069782A1中已经报道了其作为Na+/H+逆向转运蛋白的额外功能及其参与氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸或L-组氨酸)的产生和积累。其中，公开了肠杆菌科的细菌，其具有增加的基因表达水平，所述基因选自nhaA、nhaB、nhaR、chaA、mdfA及其组合。

然而，WO 2007/069782 A1没有提及增强的mdfA表达水平对L-色氨酸生产力的影响。

鉴于上述情况，仍需要进一步优化特别是肠杆菌科的适合产生L-色氨酸的那些菌株，并使用肠杆菌科的这些微生物提供用于发酵生产L-色氨酸的改进方法。此外，特别希望建立能够调节参与芳族化合物转运过程的基因表达水平的新技术，因为(甚至少量)芳族氨基酸衍生物和中间体引起的毒性需要有效的转运系统。然而，基因表达水平应该适应细胞膜中丰富的转运蛋白的特定需要，而不影响细胞适应性和一般生产能力。

发明内容

本发明提供了一种生产L-色氨酸的方法，该方法包括在发酵培养基中培养产生L-色氨酸的微生物，所述微生物属于肠杆菌科；其中所述产生L-色氨酸的微生物已通过增强mdfA基因的表达水平或通过增强mdfA等位基因的表达水平而被修饰。

此外，本发明涉及通过转化、转导或接合来制备产生L-色氨酸的微生物的方法，其中所述转化、转导或接合通过载体进行，所述载体包括：

a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸序列；

b)在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补链杂交的多核苷酸；

c)根据a)或b)的多核苷酸的天然存在的突变体或多态形式；

d)与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的多核苷酸；

e)相对于SEQ ID NO：1的核苷酸序列包含1至60个核苷酸的取代、缺失、插入或添加的多核苷酸；

f)编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；