[发明专利]斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法

说明书

本发明公开了斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法，包括以下步骤：选择斑马鱼gys1基因序列的第四个外显子序列设计gys1基因敲除的靶点，gys2基因序列的第三个外显子序列设计gys2基因敲除的靶点，根据上述靶点序列设计扩增引物，以pUC19‑scaffold plasmid为模板进行PCR扩增，经纯化和体外转录获得gys1和gys2基因敲除靶点gRNA，再将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼受精卵中，获得稳定遗传的斑马鱼gys1和gys2基因纯合突变体。斑马鱼产卵量大，繁殖周期短，胚体透明，有助于进一步研究人类糖原贮积症的发病进程及详细机制。

技术领域

本发明涉及斑马鱼基因遗传学技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法。

背景技术

糖原贮积症(glycogen storage disease,GSD)是一组由于参与糖原合成与分解过程的酶生成障碍而引起一系列不同症状的人类先天性糖代谢异常疾病，主要涉及肝脏、肌肉和脑中的糖原代谢异常。糖原贮积病有多种突变基因和遗传模式，其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ型以肝脏病变为主，Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ型以肌肉组织受损为主(曾召琼,易帆,谢小兵.糖原累积病研究进展[J].检验医学与临床,2018,15(22):3458-3461.)。

糖原合成酶(glycogen synthase,GS)是肝糖原合成的关键酶，分两个亚型：GYS1和GYS2。GS的活性受损导致肝脏中糖原储存大量减少：GYS1表达于骨骼肌和心肌，其突变表现为易疲劳，运动不耐受，累及心脏可引起肥厚性心肌病，突发心脏骤停；GYS2表达于肝脏中，催化α-1,4-葡萄糖残基连接到糖链的非还原端，其突变引起婴儿期或儿童期出现非胰岛素依赖性糖尿病症状，长期禁食后酮症性低血糖和低乳酸血症，进食后缓解，餐后高血糖和高脂血症，伴有肝肿大(曾召琼,易帆,谢小兵.糖原累积病研究进展[J].检验医学与临床,2018,15(22):3458-3461.)。

研究报道，有三兄妹因为GYS1基因发生基因突变(R462→ter)，形成终止密码子，导致心脏和肌肉组织糖原不足，哥哥在10.5岁时死于心脏骤停，尸检报告显示：该病人的心脏左心室壁增厚，死因为肥厚性心肌病，2年后该病人的弟弟(11岁)出现肌肉疲劳、肥厚性心肌病、运动时心率和血压异常等症状。(Kollberg G,Tulinius M,Gilljam T,Ostman-Smith I,Forsander G,Jotorp P,Oldfors A,Holme E.Cardiomyopathy and exerciseintolerance in muscle glycogen storage disease 0.N Engl J Med.2007Oct 11；357(15):1507-14.PMID:17928598.)。另有研究报道，一个日本女孩患有肌肉GSD0病，该病人从5岁开始就反复发作劳力性晕厥并伴有肌肉无力和疼痛，直到12岁死于心脏骤停，她11岁时肌肉活检显示所有肌肉纤维的糖原耗尽(Sukigara S,Liang WC,Komaki H,Fukuda T,Miyamoto T,Saito T,Saito Y,Nakagawa E,Sugai K,Hayashi YK,Sugie H,Sasaki M,Nishino I.Muscle glycogen storage disease 0presenting recurrent syncope withweakness and myalgia.Neuromuscul Disord.2012Feb；22(2):162-5.PMID:21958591.)。