[发明专利]羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法

说明书

本发明公开了一种羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法，以羊传染性胸膜肺炎支原体菌株BNCC126187株(Mycoplasma ovipneumoniad)基因组DNA为模板，通过PCR扩增目的基因RPS11，将其克隆到pET28a(+)载体，成功构建了重组质粒pET28a‑RPS11，并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，通过包涵体诱导表达重组RPS11蛋白并鉴定及纯化。本发明完成了RPS11蛋白的重组表达，制备出特异性较好的选择性免疫抗原，建立的间接ELISA检测方法为羊传染性胸膜肺炎的血清学检测诊断及流行病学调查提供了有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及畜牧兽医技术领域，特别是一种羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法。

背景技术

年来，随着我国肉羊养殖数量及养殖规模的不断增大，频繁的跨区域引种及大量的活羊、肉品的市场交易和流通，因受长途运输应激、不同季节和地域气候特性、饲养管理方式的差异等不利因素的影响，导致羊传染性胸膜肺炎(Infectious pleuropneumonia insheep and goats)的发生变得更加频繁，其流行区域及范围更加广泛，已成为一种危害国内肉羊养殖生产的主要常发条件性传染病，严重影响肉羊产业的健康可持续性发展^[1-3]。该病潜伏期较长，当临床症状显著时往往处于发病晚期，给治疗带来困难。由于肉羊养殖产业的特殊性，目前，国内肉羊专业规模化养殖相对滞后，大部分地区仍以农户小规模分散养殖为主，其分布主要在交通相对欠发达的边远山区，无论从养殖设施条件、规范化养殖生产技术的应用，到早期特异性检测诊断技术手段等，都难以满足该病有效防控的技术条件及要求。^[4-6]

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)是羊传染性胸膜肺炎的主要致病源，国内对绵羊肺炎支原体分离株的分子特性、免疫原性蛋白的研究分析结果表明，核糖体蛋白质(ribosomalprotein,RP)在进化过程中高度保守，在哺乳动物中其氨基酸序列均相同，在原核细菌、真菌和酵母中也极其相似。RP是一种RNA结合蛋白，与核糖体RNA共同参与蛋白质的合成。其功能是组装、稳定rRNA，协助rRNA完成译码功能。根据来源的大小亚基RP分别被命名为RPL和RPS。30SRPS11是参与核糖体构成的重要亚单位，国内研究学者田露露等对其抗原表位集中区进行克隆、表达，对表达的重组蛋白进行了反应原性和免疫原性分析，证实发现30SRPS11是绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae,MO)的重要抗原，能刺激机体产生相对较强的免疫反应。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术缺陷，提供一种羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法。

本发明的技术方案如下：

本发明通过羊传染性胸膜肺炎支原体菌株全基因序列设计引物扩增目的基因RPS11进行克隆，构建重组质粒pET28a-RPS11，转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，并通过包涵体诱导表达重组RPS11蛋白并鉴定及纯化。

其中，引物设计与合成方法是：利用primer 5.0软件，根据Genebank中的基因序列，对ribosomal protein S11[Mycoplasma ovipneumoniae NM2010]基因序列设计引物：

RPS11-F：5’-GGATCCATGGCAACTAATACTCGT-3’；

RPS11-R：5’-CTCGAGCCTTTTTTCCTGACG-3’。