[发明专利]一种提高腺相关病毒产量的生产工艺

说明书

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高腺相关病毒产量的生产工艺。本发明提供的提高腺相关病毒产量的生产工艺，主要是将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞的过程中，向含有贴壁细胞的培养液中加入促细胞增殖因子，促进细胞增殖，为腺相关病毒提供更多的载体，并选择特定的三种质粒载体，提高了腺相关病毒的体外存活时间。本发明提供的提高腺相关病毒产量的生产工艺，可以显著提高293T细胞生产腺相关病毒的产量，且操作方法极其简单，为腺相关病毒的规模化生产提供了有力依据。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高腺相关病毒产量的生产工艺。

背景技术

大约五十年前，科学家假设，外源DNA的遗传修饰可能对遗传性人类疾病的治疗有效。基因疗法通过将遗传物质导入细胞补偿或纠正异常基因，引入的正常基因拷贝能够帮助恢复必需蛋白质的功能。这种“基因治疗”策略为后续研究提供了理论基础，即通过一次治疗就可以获得持久且有效的临床治疗。这基因治疗种技术已从构想中来到了现实，那就是重组腺相关病毒(AAV)基因治疗技术，其具有安全性、有效性、特异性等多种优势，目前作为第一个已被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市了。

目前AAV生产主要的方法为三质粒转染293T细胞方法，其操作简单、快速，但AAV包装颗粒量低产，这大大限制了AAV规模化生产。因此，开发一种提高AAV产量的生产工艺技术，是目前取得大规模AAV生产技术关键之一。

中国专利CN103627675B公开了一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法，该方法是通过在用于生产流感疫苗毒株的细胞中过表达FMRP蛋白或含有KH2结构域的功能性截短体蛋白，从而提高流感病毒疫苗毒株在细胞生产中的产量，该方法虽然可以提高流感病毒的产量，但是该方法仅适用于流感病毒，还涉及RNA干扰技术，这一操作不仅使生产过程更繁琐，而且，对产量的提高效果具有不确定，如果干扰失败，不仅无法提高毒株产量，还会出现别的病毒侵入的危险。

综上可知，现有技术中的腺相关病毒的生产工艺普遍存在操作复杂，产量低，适用范围窄，容易引入其他病毒等缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的缺点，本发明的目的在于提供一种提高腺相关病毒产量的生产工艺，该生产工艺适用于腺相关病毒的9种血清类型，而且操作方法简单，成本低，产量高，可以高效生产单一病毒。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种提高腺相关病毒产量的生产工艺，包括如下步骤：

S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含8％～10％牛血清的营养液培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，接种入10～15cm平皿进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO₂培养箱的培养参数，培养20-28h，细胞汇合率达到80％～90％，得含贴壁细胞的混合液；

S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15～25mL含牛血清及促细胞增殖因子7～10g的DMEM培养基，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放在CO₂培养箱中，设置好孵育的培养参数，培养20～28h，弃掉上清液，加入含有CaCl₂溶液及促细胞增殖因子的无血清DMEM培养液，再设置好孵育后的培养参数培养，进行孵育培养24～72h，得含腺相关病毒的混合液；

S4、腺相关病毒液的收集：收获步骤S3所得含腺相关病毒的混合液的细胞和上清液，进一步纯化，即得。