[发明专利]一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法

说明书

本发明公开了一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，首先，利用番茄来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以甜菊甙为原料糖基化反应合成莱鲍迪苷E；随后，利用甜叶菊来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以莱鲍迪苷E为原料进一步糖基化反应合成莱鲍迪苷M。本发明的方法利用分子克隆技术，获得异源表达UDP‑糖基转移酶和蔗糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌，经发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖在蔗糖合成酶分解作用下获得UDP‑葡萄糖作为糖基化反应的原材料，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。原料成本更为低廉，工艺步骤简单，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法。

背景技术

甜叶菊作为一种原产于南美洲的多年本草生植物，其茎叶中可提取出丰富的甜菊糖甙，几个世纪以来，一直被南美洲人们用作为天然甜味剂^[1]。自1976年我国从日本引进甜叶菊种植成功后，80年代后开始向全国推广种植。目前福建、安微、江苏等地已有大面积种植，总面积达100万亩，已成为全球最大的甜菊糖生产国和出口国^{[2, 3]}。甜菊糖作为目前已知的最甜的甜味剂，其甜度是蔗糖的250~450倍，而热量只有蔗糖的1/300，略带有轻微涩味。其溶解度不低，且在酸和盐的溶液中能稳定存在，保存时间长、不会结块。除此之外，甜菊糖还具备对高血压、肥胖症、糖尿病等辅助药理作用^{[4, 5]}，因此，越来越受到人们的关注。

甜菊糖是甜菊糖甙的总称，目前已从甜叶菊中分离鉴定出超过35种甜菊糖甙^[6]。甜菊糖甙结构围绕一个双萜甜菊醇为骨架，在C13位羟基和C19位羧基分别连接了不等的葡萄糖基团，其中，骨架上C16-C17之间的碳碳双键是提供甜菊糖甙甜味及功能的药理性基团^{[6, 7]}。莱鲍迪苷M，于2009年报道首次从甜叶菊新品种的叶子中被提取鉴定，其甜度为蔗糖的400倍，优于现市场上在售的莱鲍迪苷A，口感也更为干净。尽管研究人员培育了高产莱鲍迪苷M的甜叶菊新品种，但其在干叶片中的含量仍低（~0.4-0.5%），单纯使用物理手段直接从叶片中提取制备高纯度的莱鲍迪苷M，经济效益是及其低下的。

专利申请CN 201310353500.9（一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法）与专利申请CN201410019981.4（一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法）中采用的是以莱鲍迪苷A或者莱鲍迪苷D为底物原料，经UDP-葡萄糖基转移酶（来自甜菊的UGT-A和/或来自水稻的UGT-B）及蔗糖合成酶偶联催化实现的，其底物莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D的成本均远远高于甜菊甙。

专利申请CN 201410553617.6（莱鲍迪苷M的合成方法及其中间产物和合成方法）和专利申请CN 201410314371.7（一种制备莱鲍迪苷M的工艺方法）中均涉及到部分化学试剂或化学反应，且合成步骤烦琐。本方法通过生物酶催化手段，以甜菊甙纯品为原料，搭建新的莱鲍迪苷M合成路径，经两步糖基化反应制备莱鲍迪苷M，原料成本更为低廉，工艺步骤简单，具有重要的应用价值。

参考文献

[1]杨远志, 李发财, 琚争艳, 等. 甜菊糖的应用现状及发展前景 [J]. 发酵科技通讯, 2011, 40(1): 40-44.

[2]倪军明, 李军平. 甜菊糖工业发展现状与前景 [J]. 现代食品科技, 2004, 20(3): 156-158.

[3]唐志发. 甜菊糖的崛起与发展战略 [J]. 中国食品工业, 1999, 2: 52-55.

[4]KOVYLYAEVA G I, BAKALEINIK G A, STROBYKINA I Y, et al. Glycosides fromStevia rebaudiana [J]. Chemistry of Natural Compounds, 2007, 43(1): 81-85.