[发明专利]一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ:ID:NO:1。

2.根据权利要求1所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、选取RSV病毒F蛋白的胞外段，所述胞外段的序列为SEQ:ID:NO:2，将其中的Furin切割区域进行点突变，并在N端添加CD5信号肽、C端添加GCN4片段，按照人类的密码子偏好性进行密码子优化，合成该优化的基因，并亚克隆至pcDNA3.1-Neoless表达载体中，测序验证无误后，使用Qiagen质粒大量抽提试剂盒制备去内毒素质粒；

S2、选取293F细胞解冻后转移至离心管中，并加入预热至室温的FreeStyle™ 293培养基，混匀后室温离心5分钟，去掉上清后，用FreeStyle™ 293培养基重悬细胞后，将细胞悬液转移至摇瓶中，连续培养，调整细胞至对数生长期；

S3、将转染试剂及上述构建的可溶性F蛋白表达载体混合均匀；取1×PBS缓冲液至6孔板中，加入pcDNA-CMV-Soluble F protein质粒后充分混匀，加入转染试剂，混匀，室温下静置10分钟；

S4、将上述转染复合物加入到293F细胞中充分混匀，将细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，培养6~8小时后，加入新鲜的FreeStyle™ 293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养；

S5、连续培养7天后，离心收集培养基上清，用滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用体外免疫层析检测试剂检测卡进行检测后，继续用帕利珠单抗磁珠亲和层析纯化目的重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S1中CD5信号肽的序列为SEQ:ID:NO:3。

4.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S1中GCN4片段的序列为SEQ:ID:NO:4。

5.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S2中所述细胞悬液在摇瓶中连续培养期间，当细胞密度达到2*10^6细胞/mL时，进行稀释传代，细胞的接种密度为5*10^5细胞/mL。

6.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S3中转染试剂为LVTransm转染试剂。

7.根据权利要求6所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S4中转染复合物为DNA/ LVTransm。

8.根据权利要求2所述的一种表达呼吸道合胞病毒F蛋白的制备方法，其特征在于：所述S5中体外免疫层析检测试剂检测卡为 Alere BinaxNOW® RSV 检测卡。