[发明专利]液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒

说明书

本发明公开一液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒，取检测血清或检测血浆，加入甲氨喋呤内标定量，通过将游离维生素B12从维生素B12中游离出来，提供氰基离子，稳定钴胺素异构体为氰钴胺素；利用固相萃取法对维生素B12进行富集的步骤，并采用串联质谱检测进行人体血浆或血清内维生素B12的测定，特异性强，灵敏度高，可满足临床检测的需求。

技术领域

本发明涉及维生素检测领域，特别涉及一种液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒。

背景技术

维生素B12是一类含有咕啉(corrin)环的类咕啉(corrinoids)化合物,维生素B12通俗名称又叫做“钴胺素(cobalamin)”,是唯一的一种含金属元素的维生素。然而人血清中大约1/3的维生素B12并非钴胺素，而是其他的类咕啉，它们在代谢上对人体是不具有生物学活性的。甲钴胺素和5′-脱氧腺苷钴胺素是维生素B12的活性型，也是血液中存在的主要形式。

人体不能合成维生素B12，主要依靠动物性食品提供，含量丰富者有肝肾组织、肉类、蛋类和乳类制品。维生素B12在人体代谢当中起到非常重要的作用，其可作为甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的辅酶，参与甲基丙二酸单酰辅酶A转变为琥珀酸单酰辅酶A的反应，该反应在奇数碳原子脂肪酸的代谢中起重要作用。维生素B12亦可作为β-甲基天门冬氨酸变构酶的辅酶，参与β-甲基天门冬氨酸向谷氨酸转化的过程。此外，维生素B12与叶酸协同参与甲基转移作用，影响体内的多种代谢过程。维生素B12缺乏时，可导致DNA合成障碍和巨幼细胞贫血，影响神经髓鞘形成，从而出现神经系统症状。

另外，人类血浆中存在3种维生素B12的结合蛋白，即TCⅠ、TCⅡ、TCⅢ(transcobalaminⅠ、Ⅱ、Ⅲ)，正常情况下，约80％以上的血清维生素B12 会与TCⅠ和TCⅢ结合，称为血清全结合咕啉，仅20％与TCⅡ相结合，形成holoTCⅡ。全结合咕啉的半衰期约为240小时，holoTCⅡ的半衰期仅为6分钟。因此总血清维生素B12含量可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素B12水平。

目前，维生素B12的检测方法有多种，包括化学发光免疫法、微生物法和同位素放射免疫方法等，然而免疫检测方法和微生物方法有很多的弊端，如下：

第一、免疫反应对反应条件的要求比较严苛,必须保证适宜的pH、电解质环境和排除交叉反应；

第二，不同厂商检测试剂盒检测结果存在显著差异，即免疫反应的检测准确度得不到保障；

第三，特异性差，不能有效区分钴胺素和类咕啉，不能给出准确的维生素B12含量；

第四，放射性免疫法存在放射线辐射和污染等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对目前检测维生素B12存在的缺陷，提出一种液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒，特异性强，灵敏度高，可满足临床检测的需求。

为了实现以上任一发明目的，本发明提供一液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法，适用于测定血清或血浆中维生素B12，包括以下步骤：

(1)维生素B12的提取和稳定：

维生素B12的提取：将结合态维生素B12从钴胺素结合蛋白中游离出来；

维生素B12的稳定：提供氰基离子，转化钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等)为相对稳定的氰钴胺素；

(2)净化浓缩氰钴胺素；以及

(3)串联质谱检测；

其中色谱条件选择为：

色谱柱：2.6μm Polar C18LC Column 50x 2.1mm；

流动相A液：含有甲酸的乙酸铵水溶液；