[发明专利]一种细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及应用

说明书

本发明公开了一种细胞珠蛋白‑人源乳铁蛋白肽的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是由穿膜肽（TAT）、细胞株蛋白（Cytoglobin,CYGB）与人乳铁蛋白肽（human Lactoferricin,hLFcin）串联构成；利用TAT实现融合蛋白分泌到胞外，方便纯化；利用CYGB蛋白带动乳铁蛋白肽的表达，并减轻抗菌肽对宿主菌的抑制；CYGB的抗氧化性有利于增加抗菌肽的储存稳定性。本发明可实现规模化生产TAT‑CYGB‑hLFcin融合蛋白，避免了融合蛋白设计Linker的繁琐步骤，并利用融合蛋白稳定特性简化了纯化该融合蛋白的方法，该融合蛋白显示出了作为水产品保鲜剂添加剂应用于水产品保鲜的前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞珠蛋白-人乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其应用。

背景技术

水产品在国人的日常生活饮食中已占有重要的位置，人们对水产品的喜食程度也进一步增强，确保其新鲜品质不仅是提升人们生活品质，更是人们饮食安全的保障。其中保质期长、柔软多汁、色泽鲜红、味道鲜美的水产品，深受消费者欢迎，日益成为水产品消费的主流。由于其在0-4℃加工、流通并不能完全抑制微生物的生长繁殖，水产品品质发生变化主要是由于其自身含有的大量细菌，如链球菌书、假单胞菌属、杆菌属等，导致其货架期短且色泽易变，妨碍其水产品制备及卫生安全。采取合适的保鲜方法延长水产品的货架期及保护色泽就成为推动水产品市场发展的关键。在水产品的加工过程中添加保鲜剂，是稳定冷鲜肉品质，延长货架期最为有效的手段。然而近年来，由于化学保鲜剂（如苯甲酸钠、对羟基苯钾酸酯、亚硫酸盐等）潜在致癌、致突变、致畸的可能性，加上新型化学合成保鲜剂开发越发艰难，使得天然保鲜剂（如含硫芳香油、抗菌肽等）越发受到人们的青睐。

乳铁蛋白肽（Lactoferricin, LFcin）是一种新型抗菌肽，由胃蛋白酶作用乳铁蛋白N端释放的一段多肽，其几乎具备乳铁蛋白所有生物学活性，抗菌作用强，且源于哺乳动物，不含稀有氨基酸和外源化学成分，无毒性。人源乳铁蛋白肽（human Lactoferricin,hLFcin）人乳铁蛋白N端第18到40位氨基酸组成的一段多肽，由23个氨基酸组成，对大肠杆菌和白色念珠菌都有抗菌活性，在抑菌及防腐中应用广泛，是天然保鲜剂、畜禽饲料添加剂等良好的原料。

细胞珠蛋白（cytoglobin, CYGB），最早在患有肝纤维化的脊椎动物肝星状细胞中发现，定位于染色体17q25的人CYGB基因含有4个外显子和3个内含子，编码190个氨基酸残基，分子量约21.4 kDa。研究表明CYGB主要存在于细胞质中，具有抗炎、抗纤维化、抗癌等作用，能够很好的清除氧自由基和过氧化物酶活性的作用。研究还发现CYGB可在大肠杆菌表达系统中高效表达，可以显著降低产物对宿主毒性、且实现高产。

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide, CPP），又称为蛋白转导域或膜转导肽，是一种由20个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽，能够运载生物活性物质如肽、蛋白、反义核苷酸和脂质体等许多物质，一般来源于可穿透生物屏障的富含碱性氨基酸的多肽或蛋白质。在CPPs中，富含精氨酸的CPPs研究最广泛，如HIV-1中的TAT（101个AA）反式激活因子，TAT^47-57是最短的CPPs之一，含有11个氨基酸，含有6个精氨酸残基和2个赖氨酸残基已证明通过TAT的N端连接的融合蛋白能够在体外转导几乎所有检测过的细胞类型。

中国发明专利CN108794635 A公开了一种牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白、基因及其应用，它采用基因工程的方法构建牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合重组质粒，然后在真核表达牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白。然而由于溶菌酶与抗菌肽对基因工程宿主菌具有一定的细胞毒性，通常采用融合其他蛋白的形式进行表达，以减弱该细胞毒性。中国发明专CN108660147 A一种一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，它将组蛋白样蛋白HU与牛乳铁蛋白肽融合在大肠杆菌中表达，之后纯化融合蛋白。然而这两种方法所用的融合蛋白本身对最终的产品功能没有帮助，主要方便纯化。

发明内容