[发明专利]一种淘选和扩增培养肝脏干细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种淘选和扩增肝脏干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括液体基础培养基、细胞因子、腺苷酸环化酶激活剂、Wnt信号通路激活剂、TGFβ信号通路抑制剂和ROCK1抑制剂。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括细胞培养添加物。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述液体基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、RPMI1640培养基或Advance DMEM/F12培养基中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述细胞培养添加物包括N2细胞培养添加物、B27细胞培养添加物、谷氨酰胺替代物、尼克酰胺或胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合物中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述谷氨酰胺替代物的浓度为0.1-1％；

优选地，所述尼克酰胺的浓度为1-10mM；

优选地，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合物的浓度为0.1-1％；

优选地，所述N2细胞培养添加物的浓度为0.1-1％；

优选地，所述B27细胞培养添加物的浓度为0.1-1％。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基，其特征在于，所述腺苷酸环化酶活化剂为Forskolin；

优选地，所述腺苷酸环化酶活化剂的浓度为1-50μM；

优选地，所述细胞因子包括表皮生长因子、骨形态发生蛋白4或成纤维细胞生长因子10中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述细胞因子的浓度为3-150ng/mL。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的培养基，其特征在于，所述Wnt信号通路激活剂包括糖原合成酶激酶3α/β抑制剂CHIR99021和/或重组R-spondin蛋白；

优选地，所述糖原合成酶激酶3α/β抑制剂CHIR99021的摩尔浓度为1-20μM；

优选地，所述重组R-spondin蛋白的质量浓度为1-100ng/mL；

优选地，所述TGFβ信号通路抑制剂包括A83-01和/或RepSOX，优选为A83-01；

优选地，所述RepSOX的浓度为1-5μM；

优选地，所述A83-01的摩尔浓度为0.5-10μM；

优选地，所述ROCK1抑制剂包括Y-27632和/或Thiazovivin，优选为Y-27632；

优选地，所述Thiazovivin的浓度为0.5–10μM；

优选地，所述Y-27632的摩尔浓度为1–10μM。

6.一种淘选和扩增肝脏干细胞的方法，其特征在于，采用权利要求所1-5中任一项所述的培养基；

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)将肝脏经预处理得到细胞悬液；

(2)将步骤(1)的细胞悬液去除肝实质细胞，得到非肝实质细胞；

(3)将步骤(2)的非肝实质细胞重悬离心，得到细胞沉淀；

(4)将步骤(3)的沉淀采用权利要求1-5中任一项所述的培养基重悬并接种；

(5)挑取步骤(4)淘选出的肝脏干细胞克隆，接种至权利要求1-5中任一项所述培养基中扩增，消化并传代。