[发明专利]一种联合检测评估肿瘤康复状况的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种联合检测评估肿瘤康复状况的试剂盒及其检测方法，涉及医学生物检测领域，具体是一种将β‑半乳糖苷酶活性、DNA甲基化、游离DNA水平三项检测指标联合使用，用于评估肿瘤康复状况的检测试剂盒及其检测方法。本发明通过检测β‑半乳糖苷酶活性、DNA甲基化和游离DNA水平，评估肿瘤患者的康复状况，以便尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。

技术领域

本发明采用免疫及分子生物技术检测技术，是一种将β-半乳糖苷酶活性、DNA甲基化、游离DNA水平三项指标组合检测的试剂盒及其检测方法，用于评估肿瘤康复状况的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

由于城市化、工业化、老龄化及全球化进程的加剧，以及生态环境恶化、生活方式改变、生物学和遗传学因素的影响，恶性肿瘤的危险因素暴露频率与水平均不断增长，全世界恶性肿瘤发病率和死亡率均呈上升态势，已成为严重威胁人类生命和社会发展的重大公共卫生问题。根据世界卫生组织癌症研究机构数据，2012年全球恶性肿瘤新发病例超过1400万，死于恶性肿瘤人数约800万，是世界范围内主要死因。恶性肿瘤己经成为我国主要公共卫生问题，自2010年来，恶性肿瘤己经超过心脑血管疾病，成为中国人群第一大死因。肿瘤疾病发展迅速，预计到2020年全球新发肿瘤病例将达2000万，中国癌症发病率多年来也呈持续上升态势，如不采取措施，到2020年发病率将上升至400万人。

癌症本身、手术治疗、放疗、化疗或靶向治疗等对肿瘤患者的心理和生理均会造成不良影响，患者普遍存在着不同程度的心理障碍、功能异常和躯体残疾，使患者难以很好地回归社会。肿瘤康复是恢复患者因肿瘤本身或治疗造成的躯体残缺、生理功能异常、心理障碍等的综合手段。合理地评估肿瘤患者的康复状况可以有效改善患者的生存和愈后状况，制定更加精准的康复治疗方案。

β-半乳糖苷酶（β-galactosinase）是细胞溶酶体中的水解酶，可以把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。分子量54万。研究发现人类生理性或病理性衰老的细胞中尽管细胞仍然是存活的，但是分裂能力已失去。此时衰老细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。通常体积变大而扁空泡状时会有β-半乳糖苷酶活性的释放，失去增值能力。每个衰老细胞一般会释放几个分子的β-半乳糖苷酶；如血液偏酸等条件下pH 6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶的释放而易造成组织细胞衰老死亡。通过检测β-半乳糖苷酶活性可以大致了解各年龄段细胞衰老的情况，同时，可以作为肿瘤的筛选指标。

作为表观遗传学的重要组成，DNA甲基化（DNA methylation）是一种共价化学修饰，指在DNA甲基化转化酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团共价到CpG二核苷酸胞嘧啶的5碳单位上的过程。人类基因组中存在一些长度为300～3 000 bp富含CpG二核苷酸的区域，这些区域主要存在于基因的5′端，被称作CpG岛。正常情况下，CpG岛的未甲基化状态是基因转录的保证，其异常甲基化则会导致基因转录的抑制。DNA甲基化后基因序列并未发生改变，但是其表达却受到抑制。这种改变通常发生在富含CG结构的二核苷酸上，这正是维持染色体结构、细胞记忆与衰老及胚胎发育的重要部位。因此，DNA甲基化的研究对临床上肿瘤的风险评估、治疗及预后有着重要意义。

血清游离DNA（serum free DNA）是一种无细胞状态的胞外DNA，广泛存在人体的血清和血浆等体液中，主要来源于细胞核DNA和线粒体DNA，由单链或双链DNA的混合物组成，正常人血清中通常小于20 ng/ml；研究表明肿瘤患者的外周血清DNA水平大大高于正常人。这是由于肿瘤迅速生长过程中伴随肿瘤细胞不断的凋亡和坏死时细胞酶解后释放的DNA。

单独一种肿瘤康复状况的检测均有局限，采用联合检测的方法往往能更好的检测肿瘤病人的康复状况。所有疾病不是静止不动的，而是始终处于动态发展中，根据不同的康复状况选择合适的康复手段，也是需要注意的。通过β-半乳糖苷酶活性、DNA甲基化、游离DNA水平三项指标组合联合检测可以作为癌症早期诊断和预后的标志物。

发明内容