[发明专利]一种特异性检测当归ToMV病毒的IC-RT-LAMP检测方法

说明书

本发明公开了一种特异性检测当归ToMV病毒的IC‑RT‑LAMP检测方法，其步骤主要包括用ToMV的抗体IgG特异性捕获ToMV病毒粒子，利用ToMV的特异性引物进行反转录RT反应合成cDNA，再利用特异性的LAMP引物组进行LAMP扩增，反应结束后利用荧光染料肉眼观察法或琼脂糖凝胶电泳检测待检样品是否含有ToMV病毒。本发明特异性强，灵敏度达到了0.45 pg/mL，比普通PCR高100倍，且无需提取RNA，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率、为当归ToMV的检测提供了新的技术平台，可用于监控当归ToMV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

技术领域

本发明涉及一种特异性检测侵染当归的番茄花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。

背景技术

当归（Angelica sinensis），别名岷当归、干归、马尾当归、马尾归、云归、西当归、金当归、土当归，属伞形科多年生草本植物，常以根入药，具补血、活血、止痛、润肠之功效；含基本内酯(ligusiilide)、正丁烯酞内酯(n-butylidene phthalide)、阿魏酸、维生素B12、维生素E、烟酸、蔗糖和多种氨基酸，以及倍半萜类化合物等。由于成份独特，其药用价值很高，有“十方九归”之说，除补血、活血、调经止痛、润燥通便外，还有镇静大脑、护肤、减少色素沉积、抗辐射和调节非特异性免疫功能的作用，对冠心病、脉管炎、脑血管病及白细胞减少有显著疗效，对肿瘤疾病有较好的防治作用。

当归在国内多省均有分布，如云南、贵州、四川、甘肃和青海等地，特别是甘肃省岷县当归种植历史悠久，品质极佳，产量第一，素有“中国当归之乡”和“千里药乡”之称，其当归又称“岷归”，远销东南亚、港澳台以及欧美等20多个国家和地区，国内、外销售量分别占全国总产量的70%和90%以上。目前国家已在甘肃岷县建立了优质当归生产基地，当归种植已成为当地的支柱产业，种植面积逐年扩大。

随着人工种植规模和地域的不断扩大，病害对当归生产的影响日益突出。如麻口病、根腐病，其主要致病原因为真菌和线虫。病毒病也时有发生，主要危害叶片，发病初期，仅上部叶片现轻微花叶，后逐渐出现不规则的黄绿疱斑花叶，且叶片略变硬变脆，部分叶片叶缘呈不规则锯齿状，有少数叶片变细呈蕨叶状，部分叶片正常，但叶面产生疱状，叶面稍现畸形。目前已报到的侵染中草药当归的病毒种类主要有番茄花叶病毒（Tomato mosaicvirus，ToMV）。

ToMV 是烟草花叶病毒属Tobamovirus的成员之一，其寄主范围很广，能侵染茄科、十字花科、禾本科、藜科、豆科等多种植物，中草药当归也是其主要的寄主。ToMV粒子为短杆状，基因组为单链正义RNA，大小约为6.4kb，编码了3个非结构蛋白和17.6kDa的外壳蛋白（Coat Protein，CP）。通过汁液机械摩擦、种子带毒和蚜虫传播。当前防治当归病毒病首先依靠准确的病毒检测、病株移除以及无毒种苗生产等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此ToMV的检测对于当归病毒病的防治具有重要的意义。

目前，针对ToMV的检测方法主要有指示植物法、电镜技术、酶联免疫吸附法（ELISA）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等，但这些方法和技术都存在一些缺陷。

指示植物法检测速度慢，且受季节限制，多数情况下还需要结合电镜观察病原形态和血清学试验才能做出判定。电镜技术能直接观察病毒生物大分子的亚基单位，适用于一些未知病毒，以及难以提纯的病毒材料的观察检测等，但由于病毒颗粒易于降解常常影响正确诊断，并且电镜设备昂贵，难以普及，故其应用大大受到限制，一般只能用于研究。ELISA法的灵敏度不够高，易出现非特异性反应，还必须依赖酶标仪等专业设备。

RT-PCR方法检测特异性强、灵敏度高，但与本发明相比，需要提取高质量的RNA，操作复杂，所需试剂昂贵，对检测人员的技术水平要求高，除此之外，还必须依赖PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备，推广普及应用受到很大限制。