[发明专利]一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法

说明书

本发明公开了一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法，该装置包括上、下套叠的双层孔板；所述上孔板包括带若干上小孔的上板面以及位于上板面下方且与上小孔连通的若干孔道；所述孔道的孔径由上至下逐渐缩小，孔道用于放置待测植株的种子，且种子恰好卡在孔道的底部开口处；所述下孔板包括带下小孔的下板面以及位于下板面下方且与下小孔连通的用于盛放水或GUS染液的若干凹槽，所述下小孔与上小孔一一对应，所述凹槽供所述孔道插入。本发明装置通过上、下套叠的双层孔板结构实现了高通量的转基因植株筛选，减少了筛选实验的步骤，缩短了实验时间，能够快速确定上一代转基因纯合植株，以便对转基因纯合植株开展后续研究。

技术领域

本发明涉及农业基因工程技术领域，尤其涉及一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法。

背景技术

转基因技术是现代农业中常用的一种生物技术手段，能够改良农艺性状，提高农业生产。将转基因技术与常规育种技术紧密结合，能培育多抗、优质、高产、高效的新品种，大大提高品种改良效率，并可降低农药、肥料投入，在缓解资源约束、保障食物安全、保护生态环境等方面潜力巨大。

在转基因植株生产过程中，经农杆菌侵染的愈伤组织获得带有目标基因的T-DNA，除了目的基因之外，往往还伴随着报告基因一起转入植物以便于检测是否是转基因阳性植株，例如GUS基因。

GUS(β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(X-gl uc)分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。由于绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，所以GUS基因广泛用作转基因植物的报告基因。

T₀代植株往往都是单拷贝的，T-DNA随机插入任何一条染色体中(如图1)，形成植株Aa(带有T-DNA片段的为A，不带则为a)。那么，只要是阳性的植株，经过GUS染色就会表现出蓝色的特征。之后，伴随而来的是转基因植株的筛选及其对后代中纯合植株的筛选，只有当获得稳定的植株之后才能稳定遗传，便于后续研究。T₀代植株所结的种子，即T₁代，由于同源染色体中只有一条是携带有目的基因的，因此在后代植株中，根据孟德尔遗传学规律，就会出现分离。Aa的植株后代会出现AA：Aa：aa三种基因型，比例是1:2:1(如图1)。因此，T₀代植株并不能马上运用于实验或者农业生产，因为这不是一个稳定的植株。

在T₁代植株中，AA和Aa并不能通过简单的方法区别出来，两者经GUS染色后都表现出阳性。Aa如果混在其中，那么Aa的后代又会出现aa。只有AA的纯合植株，才能稳定传代(图1)。为了找到T₁代中AA植株，需要对T₁代植株进行GUS染色，找出阳性植株，也即AA或者Aa，剔除aa。之后，T₁代植株所结的种子，即T₂代，如果经GUS染色均为蓝色，则可推断T₂代所对应的上一代植株为纯合体AA。同时，这些T₂代也都是AA基因型，可直接用于繁种。相反，如果T₂代植株经GUS染色出现无色(阴性，即aa)植株，那么可以推断其上一代为杂合体Aa。

由此可见，获得一个稳定遗传的转基因植株，至少需要种植两代。特别是T₂代植株的染色，需要保证多个植株都是GUS蓝色，才能判断其上一代植株为AA纯合植株，筛选工作量巨大。

GUS基因所的表达位置有种子中表达和非种子中表达两种。对于在种子中表达的情况而言，现有技术是：将收获的一批后代种子切开进行染色；若染色后的种子均为蓝色，表明结出该批种子的植株为纯合植株。该方法直观，不需要培养幼苗，可直接对种子进行实验；但是，该方法会破坏种子，并且种子中含有淀粉，会使GUS染液浑浊，不利于GUS染液的回收利用。