[发明专利]改进的基因组编辑方法

权利要求书

1.一种用于对细胞基因组中的至少一个靶序列进行定点修饰的基因组编辑系统，其包含：

1)包含gRNA的编码序列的表达构建体，所述gRNA靶向所述至少一个基因组靶序列；

2)包含CRISPR核酸酶编码序列的表达构建体；和

3)包含gRNA编码序列的表达构建体，所述gRNA靶向所述CRISPR核酸酶编码序列中的靶序列，

其中在导入细胞后，靶向所述至少一个基因组靶序列的gRNA指导所述CRISPR核酸酶靶向所述至少一个靶序列并导致所述靶序列中的一个或多个突变，靶向所述CRISPR核酸酶编码序列中的靶序列的gRNA指导所述CRISPR核酸酶靶向所述CRISPR核酸酶编码序列中的靶序列并导致所述CRISPR核酸酶的失活突变。

2.权利要求1的基因组编辑系统，其中所述CRISPR核酸酶选自Cas9核酸酶或其变体、Cpf1核酸酶或其变体以及单碱基编辑CRISPR核酸酶。

3.权利要求2的基因组编辑系统，其中所述Cas9核酸酶的变体选自eSpCas9(1.0)、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1或Cas9切口酶。

4.权利要求2的基因组编辑系统，其中所述单碱基编辑CRISPR核酸酶是缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶和脱氨酶的融合蛋白，所述缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶选自Cas9切口核酸酶、核酸酶死亡的Cas9核酸酶或核酸酶死亡的Cpf1核酸酶，所述脱氨酶选自接受单链DNA作为底物的胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。

5.权利要求4的基因组编辑系统，其中所述单碱基编辑CRISPR核酸酶是APOBEC1脱氨酶和Cas9切口酶的融合蛋白。

6.权利要求5的基因组编辑系统，其中所述单碱基编辑CRISPR核酸酶包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

7.权利要求6的基因组编辑系统，其中所述单碱基编辑CRISPR核酸酶的编码核苷酸序列示于SEQ ID NO:2。

8.权利要求7的基因组编辑系统，所述CRISPR核酸酶编码序列中的靶序列示于SEQ IDNO:3。

9.一种对细胞基因组中的靶序列进行定点修饰的方法，包括将权利要求1-8中任一项的系统导入细胞中。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞来自哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、大豆、花生、拟南芥等。

11.权利要求9-10中任一项的方法，其中所述系统通过选自以下的方法导入所述细胞：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和其他病毒)、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化。

12.一种产生经遗传修饰的细胞的方法，包括将权利要求1-8中任一项的系统导入细胞中。

13.权利要求12的方法，其中所述细胞来自哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、大豆、花生、拟南芥等。

14.权利要求12-13中任一项的方法，其中所述系统通过选自以下的方法导入所述细胞：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和其他病毒)、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化。