[发明专利]用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用

说明书

本发明公开了用于发酵生产L‑赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。本发明通过增加微生物体内8‑氨基‑7‑氧代壬酸化物合酶的含量，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高代谢产物的产量。进一步地，通过在诱变获得的L‑赖氨酸生产水平提高的突变株中，利用强启动子或高拷贝质粒表达ppc或ddh基因及8‑氨基‑7‑氧代壬酸化物合酶编码基因bioF，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高L‑赖氨酸的产量。

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及一种用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。

背景技术

通过DNA重组技术改造具有生产L-赖氨酸能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，现已实现工业化的生产。这些细菌的L-赖氨酸生产率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径的强化而实现的。在大肠杆菌中，ppc基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，PPC)为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶。

除了不断加强生成赖氨酸的代谢途径，打开非赖氨酸代谢的其他旁路的发酵方法，也值得我们去深入挖掘。细菌，植物和一些真菌自身能够合成生物素，比较熟知的是维生素H或维生素B7；它是一些中心代谢途径，例如脂肪酸代谢和氨基酸代谢等过程中的关键酶类的必要辅因子。生物素合成途径包括4个催化过程，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的生物素操纵子包括5个基因，分别为(bioF,bioB,bioC,bioD和bioA)和(bioW,bioB,bioF,bioD和bioA)。细菌中由bioF基因编码的8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶(8-amino-7-oxononanoatesynthase)，依赖于PLP(磷酸吡哆醛)，是一个十分保守的酶，其催化生物素合成途径的第一步。

目前，尚未见通过过表达8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因获得L-赖氨酸生产菌的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因在氨基酸或多肽发酵生产中的应用。

本发明的另一目的是提供用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。

本发明构思如下：通过增加微生物体内8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶的含量，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高代谢产物的产量。进一步地，通过在诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株中，利用强启动子或高拷贝质粒表达ppc或ddh基因及8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶编码基因bioF，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高L-赖氨酸的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因在氨基酸或多肽发酵生产中的应用。

所述8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因，通过质粒导入产氨基酸或多肽的微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。

优选地，所述8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因来自于大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)或耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)等。几种8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶的氨基酸序列相似性比对结果见图1。