[发明专利]一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法在审
| 申请号： | 201910106196.5 | 申请日： | 2019-02-01 |
| 公开（公告）号： | CN109652365A | 公开（公告）日： | 2019-04-19 |
| 发明（设计）人： | 吴兵;陈玲;顾纬卿;张徐祥;任洪强 | 申请（专利权）人： | 南京大学 |
| 主分类号： | C12N5/073 | 分类号： | C12N5/073 |
| 代理公司： | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 肖明芳 |
| 地址： | 210000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 斑马鱼胚胎 孵育 悬液 预冷 单细胞悬液 筛网 重悬 制备 一次性滴管 细胞 间歇震荡 离心步骤 培养基 分散酶 离心管 绒毛膜 过筛 移除 移入 剥落 洗涤 胚胎 清洗 消化 重复 | ||
1.一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，顺序进行如下步骤：
(1)取斑马鱼胚胎，加入Pronase E的水溶液；
(2)37℃孵育4～5min；
(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落，移入1.5mL无酶离心管中，并快速吸走Pronase E；
(4)加入E3培养基洗涤，移除，反复3～5遍；
(5)加入冰上预冷的分散酶；
(6)37℃孵育2～5min，孵育期间间歇震荡；
(7)加入FBS终止消化；
(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网，将滤液再过40μm筛网；
(9)过筛后的悬液200～500×g离心3～5min；
(10)取冰上预冷的含1％的BSA的HBSS重悬细胞；
(11)200～500×g离心步骤(10)得到的悬液3～5min；
(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次；
(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞，即得。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的Pronase E的水溶液，Pronase E的浓度为0.5～2.0mg/mL。
3.根据权利要求2所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，Pronase E的水溶液的加入体积为斑马鱼胚胎体积的2～5倍。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的E3培养基配方为：5MmNaCl，0.17MmKCl，0.33Mm CaCl2·H2O，0.33MmMgSO4·7H2O，溶剂为水。
5.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，E3培养基每次的使用量是1～2mL。
6.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的分散酶为Dispase溶于HBSS中，浓度为0.4～1.0U/mL。
7.根据权利要求6所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，对于每个斑马鱼胚胎，分散酶的使用体积为10～20μL。
8.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，FBS的使用体积为步骤(5)中分散酶体积的10～20％。
9.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(10)中，所述的含1％的BSA的HBSS的使用体积为10～20μL/个斑马鱼胚胎。
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