[发明专利]不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术

说明书

本发明涉及不同类型致泻大肠埃希氏菌检测技术，具体公开了一种不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术。通过一次多管多通路的实时荧光定量PCR检测方法，同时在相同的热循环条件下快速的检测多个基因，实现不同类型致泻大肠埃希氏菌的鉴定，操作更加快捷，易于掌握，可直接通过荧光信号实时观测结果。

技术领域

本发明属于食品及其相关物品的微生物检测领域，涉及PCR技术，尤其是涉及不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术。

背景技术

致泻大肠埃希氏菌(Diarrheagenic Escherichia coli)是一类能引起腹泻为主的大肠埃希氏菌，可以经过污染的食物导致人体发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)、产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)、及肠道集聚性大肠埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichia coli，EAEC)等，其中STEC包括肠道出血性大肠埃希氏菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC)。不同种的致泻大肠埃希氏菌具有不同的特征基因，如表1所示：

表1 五种致泻大肠埃希氏菌特征基因

目前大肠埃希氏菌的PCR确定试验，主要是取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行多次的PCR确认试验，每个样品的初筛需要配置十余个PCR扩增反应体系，对应检测不同目标基因，同时该方法需凝胶电泳后通过查找不同目标条带种类及组合，确定大肠埃希氏菌种类，耗费人力并容易导致污染，因而有必要发展新的检测方法，实现对大肠埃希氏菌的快速诊断鉴定。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术，同时在相同的热循环条件下快速的检测多个基因。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

1)制备致泻大肠埃希氏菌，作为待检测样品模板；具体方式为使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μL 0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液；加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)；

2)在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测8个目标基因，2个反应体系的引物如下表：

3)扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照反应程序，荧光定量PCR仪自动采集扩增产物的荧光信号；

反应体系25μL，配置方式如下：