[发明专利]一种NK细胞体外扩增培养的方法

权利要求书

1.一种NK细胞体外培养扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）培养瓶包被：用含肝素钠、CD16和人免疫球蛋白的包被液铺满非TC处理的T75培养瓶的底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置；8-12小时后吸弃培养瓶内液体，并用PBS洗涤培养瓶2遍，待用；

（2）外周血采集：取50ml外周血，置于10ml无菌肝素钠采血管内，2~4h内分离；

（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，获得上层血浆和下层血液，取上层血浆在56℃下灭活30min，将灭活血浆离心10min，弃去底部血小板及补体，获得自体血浆，置于4℃无菌保存；

（4）单个核细胞的分离：用生理盐水调整下层血液的细胞密度，提前在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将调整好密度的血液缓慢加入分离液上；将50ml离心管放入离心机，设置离心力为800g，升降档调至0-1档，离心30-40min，吸取单个核细胞层于50ml离心管中，加入生理盐水30~40ml，洗涤2~3次；

（5）种瓶：将细胞以1×10⁶~2×10⁶/ml的密度接种于步骤（1）包被的T75培养瓶中，加入10ml无血清完全培养基培养，其中含有步骤（3）的自体血浆、IL-2、IL-15和IL-18，放入37℃、5% CO2培养箱培养；

（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况补加新鲜的无血清完全培养基或者只补加自体血浆和IL-2、IL-15、IL-18因子，确保细胞密度在0.8×10⁶/ml~1.2×10⁶/ml；

（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的T225培养瓶中，每2～3天补一次液，同时保证细胞密度在0.8×10⁶/ml~1.2×10⁶/ml；

（8）细胞的收获和检测：连续培养细胞14~18天之后，收获细胞，并取出一部分用于细胞计数和流式细胞分析；

步骤（1）中包被液中肝素钠含量为500U/ml、CD16含量为5ug/ml、人免疫球蛋白为1mg/ml；

步骤（4）中单个核细胞分离时，细胞密度为4×10⁶~10×10⁶/ml，淋巴细胞分离液与血液的体积比例为1:1~1:3；

步骤（5）无血清培养基中自体血浆、IL-2、IL-15和IL-18的含量分别为2.5wt.%~10wt.%、1000~1200U/ml、15~20ng/ml 和20~25ng/ml。