[发明专利]非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒，包括特异性引物ASFV‑F和ASFV‑R，以及TaqMan探针ASFV‑P，探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ‑1。本发明提供的试剂盒，可以用于猪的鼻腔拭子、血液、血清、血浆、组织中的非洲猪瘟病毒检测，实现非洲猪瘟病毒的快速检测。本发明在检测ASFV的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，只需40min，大大缩短检测时间，提高检测效率。

技术领域

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测法，具体地说，涉及一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒检测方法的建立及应用方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的家猪和野猪的一种烈性、出血性传染病。急性型以高热、网状内皮系统出血和高致死率为特征，病死率接近100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的一类疫病，对养猪业危害较大。2018年8月我国辽宁省首次报道非洲猪瘟疫情，标志着非洲猪瘟传入我国，给我养猪业造成巨大损失，由于尚无有效的疫苗防治，所以建立一种快速、准确的检测方法就显得尤为重要。

非洲猪瘟病毒是ASF样病毒科的唯一成员，病毒粒子的直径为175～215纳米，呈20面体对称，有囊膜，基因组为双股线状DNA，大小170～190kb。该病毒主要以巨噬细胞为感染靶细胞，并以其特有基因数量众多、机制复杂的的病毒蛋白参与ASFV吸附、入侵宿主细胞、病毒复制与装配、逃避宿主免疫防御系统等功能，使病毒能够更有效地感染宿主细胞，引起猪的急性、热性、出血性的临床症状和病理损害。此外，非洲猪瘟存在复杂的感染循环方式，隐性感染猪以及受猪瘟病毒污染的生猪产品及其制品是非洲猪瘟引入健康地区猪群的重要传播媒介，该病毒还可感染野猪和软蜱，可在家猪与野猪之间、野猪与软蜱之间以及家猪与软蜱之间循环传播。

目前，ASF尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内，依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制，采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。OIE推荐的HAD、ELISA、IFA等血清学检测方法，耗时长，操作复杂，不适用与非洲猪瘟病毒的快速检测。实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR qPCR)具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低的优点，被广泛应用于基因检测领域。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种非洲猪瘟荧光PCR快速检测试剂盒，实现非洲猪瘟病毒的快速检测。本发明在检测ASFV的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，只需40min，大大缩短检测时间，提高检测效率。

为实现上述目的，本发明提供一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒，具体步骤如下：

(1)参考非洲猪瘟病毒24个基因型参考毒株的p72基因组序列，筛选保守区域，设计ASFV-F和ASFV-R为上下游引物，PCR扩增p72基因；PCR扩增的反应体系为20μl，其中2×Taq PCR Mix 10μl，引物ASFV-F(20μM)和ASFV-R(20μM)各1μl，模板1μl，ddH₂O 7μl，PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃60s，25个循环，72℃10min；其中引物ASFV-F和ASFV-R为：

ASFV-F：5’-ATCCGATCACATTACCTA-3’；SEQ ID NO：1；

ASFV-R：5’-GTGGTCTTCAAAGCAAAGG-3’；SEQ ID NO：2；

(2)构建pEASY-T1-p72载体，对p72基因进行序列测定；测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，作为阳性对照。