[发明专利]庆大霉素B生产菌及其制备方法和应用

说明书

本发明属于制药领域，提供了一种庆大霉素B生产菌及其制备方法和应用。所述庆大霉素B生产菌，其为棘孢小单孢菌Micromonospora echinosporaHS‑1520‑016‑89基因组中，genK基因被置换为genR和genS，且genR和genS由强启动子启动。本发明的庆大霉素B生产菌大幅度降低了庆大霉素C2b组分的生成，有效提高庆大霉素B产量，大幅度降低异帕米星的工业化生产成本。

技术领域

本发明属于制药领域，涉及庆大霉素B的生产。

背景技术

异帕米星(Isepamicin)是在庆大霉素B结构的氨基上引入异丝氨酸半合成而来的新型氨基糖苷类抗生素。作为第二代氨基糖苷类抗生素，具有稳定的抗修饰酶作用的特性，杀菌活性强、毒副作用小，被广泛应用于各种细菌感染类疾病的治疗。

庆大霉素B(Gentamicin B)是由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)产生的一种氨基糖苷类抗生素。通常情况下，棘孢小单孢菌主要产生庆大霉素C1、C1a、C2、C2a、C2b五种C组化合物，而庆大霉素B是伴随其产生的微量组分。关于庆大霉素B如何产生至今未有报道，而国内外庆大霉素B生产菌株的获得也主要是通过人工诱变和自然选育方式的传统选育模式。传统选育模式的筛选过程是完全随机的，无法有效控制杂质的产生，限制了庆大霉素B的生产水平的进一步提高。因此，在传统选育的基础上，有效借助代谢工程改造手段来定向提高庆大霉素B的产量并减少杂质，对异帕米星生产成本的降低至关重要。

发明内容

申请人在全基因组测序的基础上，经序列分析，在棘孢小单孢菌中发现了与庆大霉素B的合成密切相关的两个基因，分别命名为genR和genS，并进行了实验验证。

基于此，本发明的第一个目的是提供两个与庆大霉素B的合成相关的基因，所述基因分别为genR，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示，和genS，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示。其中，genR和genS是棘孢小单孢菌中基因。进一步地，所述棘孢小单孢菌是Micromonosporaechinospora HS-1520-016-89，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO:M 2018898；保藏时间为2018年12月17日。

在第二个方面，提供一种庆大霉素B生产菌的构建方法，所述方法以棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora HS-1520-016-89为原始菌，以genR和genS基因序列置换了原基因组上的genK基因序列，并以强启动子启动genR和genS基因。genK基因序列信息来自基因组序列，其DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，采用基因同源重组技术将原基因组上的genK基因序列置换为genR和genS基因序列。

优选地，所述genR基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述genS基因的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述强启动子选自kasOp*、SRL37、gapdhp-KR、SPL39、rpsLp-cf、SPL42。

优选地，genR基因由启动子kasOp*启动，genS基因由启动子SRL37启动。

优选地，所述方法包括：(1)构建基因工程改造质粒pYC001，所述质粒包含genK上游同源臂、kasOp*启动子、genR基因、SRL37启动子、genS基因和genK下游同源臂；(2)将所述质粒转化大肠杆菌；(3)混合培养转化的大肠杆菌和棘孢小单孢菌，得到接合转移的庆大霉素B生产菌。