[发明专利]一种分子层析PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种分子层析PCR检测方法，采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒进行检测，包括：第一步，将待测样品进行PCR反应，得到PCR产物；第二步，将待测样品标记的PCR产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫上反应，检测线或点出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫上的质控线或点，与质控线或点上的Biotin‑牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。本发明可以消除样液回流从而防止假阳性检测结果，使检测不受样品性状、复杂基质和外来气溶胶的影响，操作简便、检测结果准确。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，特别是微生物、病毒和动物源性和种属检验技术,具体是涉及一种分子层析PCR检测方法。

背景技术

胶体金免疫层析法(Colloidal gold immunochromato graphy)是九十年代兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的一个区带，当干燥的硝酸纤维膜一端接触样品液后，由于毛细管作用，样液将沿着该膜向前平行流动，当流动至固定有抗体的区域时，样液中相应的抗原与抗体发生特异性结合，可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。在胶体金免疫层析法的基础上，胶体金核酸层析也逐渐发展起来，通过生物素(Biotin)-生物素抗体，荧光素(FITC)-荧光素抗体，地高辛(DIG)-地高辛抗体等系统将PCR和胶体金免疫层析结合起来。

目前，胶体金核酸层析并没有成熟的发展起来，已有的核酸层析试纸具有以下缺点：

1.试纸外观仍然是传统的长型纸条，操作人员直接接触测试纸条，存在样品污染的情况；

2.加样区和检测区处于同一水平的两个区域，通过经毛细管侧向流的方式进行检测，存在样液回流的情况；

3.侧向流导致检测时间过长，降低检测灵敏度。样液回流导致假阳性结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种方便操作和显著提高检测准确度和灵敏度的分子层析PCR检测方法，解决现有胶体金核酸层析试纸所具有的上述问题和缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种分子层析PCR检测方法，采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒，该检测卡盒具有一体化的壳体构件，包括位于卡盒上部的第一壳体构件以及位于卡盒下部的第二壳体构件，所述第一壳体构件上设有加样窗，加样窗下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫和第一过滤膜组成的缀合物垫、由加固垫和第二过滤膜层组成的结合物垫、一至若干层吸水垫；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构；该卡盒的第二壳体构件内具有一个受力支撑构件和一个与缀合物垫连接在一起的收缩构件，受力支撑构件挤压缀合物垫、结合物垫和吸水垫，使之与加样窗紧密贴合在一起；触动收缩构件，移开与收缩构件连接在一起的缀合物垫，使缀合物垫与结合物垫相互分离，使位于结合物垫上的检测区暴露于加样窗，从而使结果可视化；

所述检测方法包括如下步骤：

第一步，将待测样品进行PCR反应，得到PCR产物；

第二步，将待测样品标记的PCR产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫上，待测样品标记的PCR产物会将缀合物垫上的交联体溶解，通过第一过滤膜的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了抗体的结合物垫上，包被在结合物垫上检测线或点的抗体与样本中的待检片段及胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫上的质控线或点，与质控线或点上的Biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；

第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。

优选地，第一步中，所述待测样品在进行PCR反应之前，增加如下步骤：