[发明专利]基于InDel标记的道地川芎鉴定用引物及鉴定方法

说明书

本发明提供了一种基于InDel标记的道地川芎鉴定用引物及鉴定方法。本发明利用12个伞形科植物的叶绿体全基因组序列和道地川芎基因组序列进行对比，获得插入/缺失差异片段所设计的4对特异DNA引物，采用该引物来鉴定道地川芎，鉴定方法包括：提取待测样品的DNA；采用这4对引物对DNA进行扩增；对扩增产物进行凝胶电泳检测，若能同时扩增出4种引物对应的特异性条带，则为道地川芎。该鉴定方法简便，样品用量少，准确性高，速度快，更加适合应用于大批量的品种鉴定，在短时间内能精确鉴定道地川芎。

技术领域

本发明属于川芎鉴定方法技术领域，具体涉及一种基于InDel标记的道地川芎鉴定用引物及鉴定方法。

背景技术

川芎(Ligusticum chuanxiong hort)为伞形科藁本属植物，以干燥的根入药。其根茎含有藁本内酯、川芎嗪、阿魏酸、挥发油等多种有效药用成分，具有活血行气，祛风止痛之功效。主要用于治疗月经不调、经闭痛经、产后瘀滞腥痛、症瘕肿块、胸胁疼痛等。由于其疗效显著、用量极大，作为大宗药材，备受关注。四川、江西、云南、吉林、甘肃、贵州等省都有川芎分布。四川省川芎产量丰富，药效价值高，为川芎道地产区，其中都江堰、彭州、崇州市是主产区，产量占全国产量的90％以上。省农业厅调查统计2016年全省川芎种植面积达10万亩以上。

随着大健康产业发展的深入和人们对中医药认识的不断提高，我国中药产业对中药材的需求不断增加，很多中药材的市场价格不断上升，当中药材生产不能完全满足市场需求的时候，部分易混品流入市场，充当正品中药材，严重影响其疗效。如川产川芎疗效好，市场价格稳定，随着川芎产品开发的深入，市场对川芎的需求越来越大，也出现了部分易混品在市场上充当川芎售卖，如抚芎、云芎、东川芎等。道地药材与非道地药材来源一致或十分相近，在形态、生物药性及化学成分等特征上也具有高度相似性，导致道地药材的鉴别不易。因此迫切地需要研究利用新的方法提高道地川芎的鉴别能力。

DNA条形码鉴定技术为中药材的物种鉴定研究提供了方便快捷的方法，DNA条形码(DNA barcoding)是利用短的，标准的DNA序列来鉴定物种的新技术。DNA条形码技术可有效的将不同种、属之间的物种进行鉴别，且其操作的简便性和高效性推动物种鉴定与进化研究的发展，为解决中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，有研究分析了中国川芎和日本川芎的ITS和mat K序列，探讨中、日了川芎物种间鉴别，其结果显示中、日川芎关系，ITS测序难以区分中国川芎和日本川芎。更有试验通过ITS2研究了川芎与羽苞藁本等藁本属的遗传差异。但在对川芎进行ITS2测序时发现，川芎ITS2序列的杂合度高，存在插入缺失的现象，难以直接测序，上述标记均不满足DNA条形码基本特征。目前研究中所采用的材料种类较少，并无市场中川芎常见的混伪品品种如抚芎、云南藁本等，并且少有结合道地川芎药材的研究报道。另外，在上述研究中所使用的多为常见通用条形码，缺乏开发新条形码的创新性研究，缺少关于市场上道地川芎及其混伪品问题的有效解决方法。

普通用于鉴定植物的DNA条形码，由于片段长度的限制，单一序列或多序列组合的条形码在物种鉴定特别是针对近缘物种之间的鉴定存在很大的局限性。叶绿体普遍存在于植物中，而相对于核基因组以及线粒体基因组，叶绿体基因组大多为母系遗传，进化速率较慢，序列较为保守。植物叶绿体基因组作为筛选DNA条形码序列的研究热点，其本身也可以作为超级条形码用于系统进化、亲缘关系以及物种鉴定研究。根据叶绿体基因组中的插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，就是cpInDel标记(叶绿体插入/缺失多态性Chloroplast Insertion/Delection polymorphism cpInDel)。有学者通过在15个小麦(Triticum aestivum)野生近缘属种基因组DNA的扩增分析发现11对InDel标记引物。也有研究发现在B73玉米(Zea mays)全基因组序列中发现13个共显性InDel标记，利用这些共显性InDel标记可以进行快速准确的玉米杂交种纯度鉴定。通过比较2种粳稻(Oryzasaliva subsp keng)的基因组序列，设计出634对InDel候选标记，可以在涉及籼粳亚种的基因定位和分子育种中应用。但是对于川芎的InDel标记尚未见相关研究。