[发明专利]一种基于诱导性启动子鉴定微生物基因功能的方法

权利要求书

1.一种基于诱导性启动子鉴定微生物基因功能的方法，其特征在于，所述基于诱导性启动子鉴定微生物基因功能的方法以运动发酵单胞菌为模式菌株，建立利用四环素诱导性启动子替换目的基因自身启动子，通过控制四环素诱导剂浓度进行下游基因表达调控；

所述基于诱导性启动子鉴定微生物基因功能的方法具体包括如下步骤：

步骤一：选取目的基因上游的基因间序列，利用启动子预测软件Softberry Operonand Gene Finding in Bacteria 预测可能的启动子，比对得到待用的启动子序列；

步骤二：针对目的基因的启动子特异性设计四条特异性引物，用于扩增得到上下游同源臂的特异性引物；

步骤三：上下游同源臂的获取：以运动发酵单胞菌ZM4 gDNA为模板，分别以引物1+引物2、引物3+引物4扩增得到上下游同源臂；

步骤四：功能基因盒的组装：壮观霉素抗性基因及四环素操纵子、四环素启动子为共有部分，三个片段构成功能盒后作为一个整体供后续使用；

步骤五：设计引物得到大肠杆菌复制起点：以pUC18质粒为模板扩增得到fragment 3；

步骤六：同源重组质粒的构建：先利用overlap PCR完成上游同源臂与功能盒，下游同源臂与复制起点的联结；胶回收得到纯的联结产物后，两片段加入大肠杆菌感受态中，利用大肠杆菌的自身同源重组完成片段的组装；

步骤七：质粒提取：转化后PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒，得到大量同源重组基因；

步骤八：电转化：用提取的质粒对运动发酵单胞菌ZM4进行电转化；

步骤九：阳性克隆验证：待平板上长出单菌落后可进行一次划线传代培养，之后挑取单克隆进行PCR验证；

步骤十：进行基因功能性检测；

所述步骤二中，针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物，用于扩增得到上下游同源臂的特异性引物，具体包括：

上游前引物；上游后引物；下游前引物；下游后引物；

所述步骤四中，设计用于扩增得到壮观霉素、四环素诱导型启动子的特异性引物包括：

壮观霉素前引物：

5’- CGGGATCCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATG -3’；

壮观霉素后引物：

5’- CGGGAGACCGTTATTTGCCGACTACC -3’；

四环素启动子前引物：

5’- ACGGTCTCCCGTTTAAGACCCACTTTCAC -3’；

四环素启动子后引物：

5’- CTGCAGCCTTTCTCCTCTTTAGATCATTTGAATACTTTTCT -3’；

所述步骤四中，PCR得到壮观霉素基因fragment 1和四环素启动子fragment 2，纯化后用改进的overlap PCR方式进行连接；

所述步骤四中，反应完成后加入最外端引物各0.8 µL，放入PCR仪内，完成下列PCR反应；回收产物得到功能基因盒；所述最外端引物为所述壮观霉素前引物和所述四环素启动子后引物；

所述功能基因盒序列为：

5’-CGGGATCCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATGGAGCACAGGATGACGCCTAACAATTCATTCAAGCCGACACCGCTTCGCGGCGCGGCTTAATTCAGGAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACTGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGGCAGGCTTATCTTGGACAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTTCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAACGGTCTCCCGTTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATCATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCGTTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGtATTCAAAtGATCTAAAGAGGAGAAAGGCTGCAG -3’。