[发明专利]利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法

说明书

本发明公开了一种利用Tag‑lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，属于腺苷A2A受体配体的筛选领域。利用Tag‑lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，该方法包括如下步骤：构建特定标签融合的目的细胞膜表面蛋白表达载体；使用HTRF荧光基团供体共价结合的标签特异性底物标记标签融合细胞膜表面蛋白；将标记的细胞或细胞膜与结合配体进行孵育，孵育后进行HTRF的检测，根据数据结果计算待测样品的Kd或Ki值。本发明的优点在于：信号强，结果可靠，运用了新的标记技术，使信号更强更稳定；基于细胞的均相检测体系，真实反应受体配体的结合情况，结果可靠。

技术领域

本发明属于腺苷A2A受体配体的筛选领域，具体涉及一种利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法。

背景技术

腺苷受体(Adenosine receptors,ARs)属于整合膜蛋白家族G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptors,GPCRs)的一员，可分为四个亚型：A1、A2A、A2B和A3。四类腺苷受体均由细胞外腺苷激活，在广泛的生理学过程中发挥重要作用，如睡眠调节、血管生成、免疫调节等。因此，腺苷受体在各种病理生理学研究中是十分重要的潜在靶点，例如睡眠障碍、癌症、炎症等。腺苷A2A受体在大脑的纹状体、脾脏内免疫细胞、胸腺、淋巴细胞和血小板中表达水平较高，在心脏、肺和血管中呈中等表达水平。腺苷受体为7次跨膜结构蛋白，其胞外部分通过与配体腺苷结合而被激活，进而胞内部分与Gs或Ggolf蛋白偶联，引发后续一系列信号传递。腺苷A2A受体激活后，与外周组织中的Gs蛋白或脑内的Ggolf蛋白偶联，激活cAMP-蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路，从而参与多种生理过程。同时，它还能够通过cAMP-PKA磷酸化CREB(cAMP responsive element binding protein)，进而干扰核转录因子NF-κB(nuclear factor-κB),参与基因表达的调控。由于腺苷A2A受体具有以上所述重要病理和生理功能，使其成为现今国内外新药研发领域非常热门的靶点之一。

目前，常规筛选腺苷A2A受体配体的方法是建立在细胞培养基础上的同位素标记法。

同位素标记技术是选用适合的不同的同位素对腺苷A2A受体和配体分别进行标记。将标记好的腺苷A2A受体、配体、待测样品共同孵育一定时间后，选择合适的测量方法和工作条件进行检测。如果腺苷A2A受体和配体结合，则能检测到两种同位素信号靠近在一起或重叠；若两者没有结合或腺苷A2A受体与待测样品发生了结合，则两种同位素信号分散在不同位置。

同位素标记作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)放射性污染，对于操作环境的安全性级别要求高；2)对于操作人员的专业度要求高；3)样品预处理繁琐，实验步骤多，耗时长；4)无法达到高通量，难以解决待测样品多的难题；5)检测仪器精度要求较高、参数设置复杂；6)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差、不稳定；7)标记用同位素在反应过程中容易产生杂质影响直接影响结果准确性；8)放射性实验，实验过程或阶段性实验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，需要及时作去污染处理和放射性废物处理。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，用于腺苷A2A受体配体的筛选。通过本发明，无论是多肽、抗体、小分子化合物或者复合分子均可使用本方法进行检测。

利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一，构建特定标签融合的目的细胞膜表面蛋白表达载体，所述载体为SNAP-tag,CLIP-tag或HaloTag融合的目的蛋白中的一种；

步骤二，利用Tag-lite技术将构建好的载体转染细胞使其表达此融合蛋白，所述Tag-lite技术兼容瞬时转染细胞或稳转细胞株；