[发明专利]利用结合HTRF技术的甲基转移酶通用酶活分析法筛选抑制剂/激动剂的方法

说明书

本发明公开了一种利用结合HTRF技术的甲基转移酶通用酶活分析法筛选抑制剂/激动剂的方法。利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：配制待检测的酶、反应底物、SAM、HTRF Donor的anti‑SAH antibody和偶联HTRF Acceptor的SAH；对待测样品进行系列浓度梯度稀释或固定浓度稀释；在微型板中依次加入酶、待测样品、底物和SAM，反应一段时间；进行HTRF读值与数据处理分析，计算样品IC50或抑制率。本发明的优点在于适用于所有抑制剂、激动剂或反向激动剂的筛选，无论是抗体、蛋白、多肽、小分子化合物或复合分子均可检测。

技术领域

本发明属于抑制剂/激动剂的筛选领域，具体涉及一种利用结合HTRF技术的甲基转移酶通用酶活分析法筛选抑制剂/激动剂的方法。

背景技术

基因的表达和转录对于各种各样的细胞进程都密切相关，其调控机制包括受DNA序列和转录因子影响的转录及转录前调控，以及转录后水平的表观遗传的调控。表观遗传的调控有多种途径，包括DNA甲基化、核小体重塑组蛋白变体和组蛋白的翻译后修饰。直接参与组蛋白翻译后修饰的蛋白可分为三类：产生这些修饰的酶、识别修饰的蛋白以及去除修饰的酶。组蛋白的翻译后修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、类泛素化、泛素化和糖基化等。由于表观遗传调控在细胞分化、增殖、发展和维持细胞形态等重要细胞进程中都能发挥十分关键的作用，因此已成为目前非常热门的研究领域。甲基化修饰作为表观遗传调控重要的组成部分之一，已成为科研人员和新药研发领域关注和研究的重点。由蛋白甲基转移酶(protein methyltransferases，PMTs)和去甲基化酶(demethylases，KDMs)引起的组蛋白转录后修饰，在调节基因表达和转录发挥重要作用，并且它与癌症和其他多种疾病密切相关。此外，这类酶中很大一部分还会靶向组蛋白以外的其他蛋白，从而参与并影响多种重要生理途径。上述特性使它们在人类疾病中发挥关键的生物学功能和影响。除了组蛋白能被甲基化之外，DNA、RNA、糖类和小分子代谢物都能在甲基转移酶和去甲基化酶的作用下进行甲基化修饰，从而对生物进程发挥一系列影响。因此，甲基转移酶和去甲基化酶已经成为目前药物研发领域十分热门的潜在治疗靶点之一。

S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-methionine,SAM)是甲硫氨酸的活性形式，在生物体内各种代谢过程中起重要作用，参与人体内100多种不同甲基转移酶的催化作用，并且与多种酶的活性密切相关。在甲基转移酶催化作用中，SAM可作为甲基供体，在酶催化下将甲基转移到相应底物(组蛋白、多肽、核小体、DNA、RAN等)上，随后生成副产物S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)。甲基转移酶通用酶活评价分析方法就是利用这一特性，通过检测SAH的含量变化，从而评估催发反应中酶的活力和反应效率等，进而筛选有效抑制剂。因此，凡是在催化反应中生成SAH的甲基转移酶均可使用此方法进行检测并筛选抑制剂或激动剂。

目前，常用的筛选甲基转移酶抑制剂的方法是ELISA。

ELISA，即酶联免疫吸附实验，将抗SAH的抗体包被在高吸附的96孔检测板中，孵育过夜后洗掉多余抗体，加入待测样品(甲基转移酶反应后)，孵育后再次洗掉多余未结合样品，然后加入标记有HRP(辣根过氧化物酶)的抗SAH的抗体，第三次孵育并洗涤，最后加入HRP的显色试剂，反应一定时间后在酶标仪下读数。根据信号判断样品中SAH的相对含量，从而评估抑制剂对甲基转移酶反应的抑制效果。

ELISA作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤多，耗时长,需要经过多次洗板、加样、显色等，至少需要一天的时间；2)无法达到高通量，难以解决药物选样品多的难题；3)因操作步骤繁多易产生实验误差，以致结果重复性差、不稳定。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了结合HTRF技术的甲基转移酶通用分析方法，用于筛选其抑制剂。通过本发明，可实现简单快速筛选酶的抑制剂，且能检测所有产物为SAH的酶，对于反应底物也不受限制，为快速高效的筛选甲基转移酶抑制剂提供了一种通用便捷的方法。