[发明专利]染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，其特征在于，步骤包括：

1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；

2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；

3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；

4）进行多重PCR扩增反应；

5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；

6）构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p/19q联合杂合性缺失。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1），一部分SNP选自1p36.3区段和19q13.3区段；另一部分SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，且该SNP在基因组中的距离大于300kb。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1），1p和19q上各选择10个SNP位点，其中，1p 上5个SNP位于1p36.3区段，19q上5个SNP 位于19q13.3区段。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述原始引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:40所示；所述多重扩增引物序列如SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:80所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4），PCR反应体系包括：2×PlatinumMultiplex PCR Master Mix 15µl，80µM多重扩增混合引物 10µl，1ng/µl样本DNA 5µl，总体积30µl；PCR反应条件：95℃ 2min；95℃ 30s，60℃ 90s，72℃ 20s，30个循环；72℃10min；4℃保持。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5），在产生5’磷酸末端和3’磷酸末端后，还包括有如下步骤：使用T7核酸内切酶Ⅰ切断暴露的单核苷酸单链，将原始U往5’方向的序列全部切掉。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5），反应体系包括：无核酸酶超纯水4.3µl，部分消化反应缓冲液2.2µl，尿嘧啶DNA糖基化酶0.5µl，核酸内切酶Ⅷ 0.5µl，T7核酸内切酶Ⅰ0.5µl，多重扩增产物14µl，总体积22µl；反应条件：37℃ 20分钟，10℃ ≤1小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5），所述部分消化反应缓冲液的组成成分为：500mM乙酸钾，150mM Tris-乙酸，100mM 乙酸镁，1g/ml BSA，用乙酸调至pH 7.9，25℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6），判断方法包括如下步骤：

61）将测序结果与hg19序列比对，获得所有SNP的等位型频率；

62）识别杂合型SNP；

63）如果杂合型SNP两个基因型的比例在45%～55%之间，则判定该SNP未发生联合杂合性缺失，否则认为该位置发生了联合杂合性缺失；

64）如果染色体臂上任意一个杂合型SNP被判断为发生了联合杂合性缺失，则判定该位点所处染色体臂发生了联合杂合性缺失；

65）当1p和19q均发生了联合杂合性缺失时，判断为该染色体发生了1p/19q联合杂合性缺失；如果某条染色体臂上的所有SNP均为纯合型，则无法判断该染色体是否发生了联合杂合性缺失。

10.用于权利要求1-9任一项所述方法的试剂盒，其特征在于，包括：多重扩增引物、尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶Ⅷ。